Identification and functional characterization of protein domains in the transcription factor TWIST

Saethre-Chotzen-Syndrom ist eine autosomal dominant vererbte Entwicklungsstörung mit vorzeitiger Fusion der Schädelnähte. Es wird durch Änderungen der Nukleotidsequenz innerhalb oder in der Nähe des Gens TWIST1 verursacht. Dieses Gen kodiert für einen bHLH-Transkriptionsfaktor, der die osteogene Differenzierung verschiedener Zielgene durch transkriptionale Kontrolle hemmt. Das Ziel meiner Arbeit war es, funktionelle Domänen im TWIST-Protein zu charakterisieren und Interaktionspartner für TWIST und seine Motive, besonders für NSEEE und WR, zu finden. Dementsprechend sollte in der vorliegenden Studie untersucht werden, wie Mutationen im TWIST1-Gen die Proteinfunktionen beeinflussen. Evolutionäre Vergleiche der TWIST-Proteine verschiedener Spezies zeigen an, dass TWIST zusätzlich zum bHLH-Motiv vier konservierte Domänen, NSEEE-, NLS1-, NLS2- und WR-Domänen, enthält. Man geht davon aus, dass die bHLH-Domäne für eine Heterodimerbildung mit anderen bHLH Proteinen, wie dem E12-Protein oder dem SEF2-Protein, verantwortlich ist. Die Funktionen von NSEEE, NLS1, NLS2 und konservierten WR-Motiven sind zur Zeit noch kaum erforscht. Zuerst fokussierte ich die Untersuchungen auf die funktionelle Charakterisierung der NLS1- und NLS2-Domänen als mögliche Kernlokalisierungssignale in TWIST. Speziell wurden die Effekte verschiedener NLS-Substitutionen in TWIST auf die zelluläre Lokalisation durch Immunofluoreszenz-Assays geprüft. Dabei wurde TWIST-NLS1 mit veränderter Aminosäure K38R im Zytoplasma von transient transfizierten U2-OS-Zellen gefunden. Dies lässt vermuten, dass NLS1 funktionell ist und essentiell am Kerntransport von TWIST beteiligt ist. Zusätzlich, um die Rolle von TWIST-NLS2 bei der Kernlokalisation zu verstehen, wurden die Aminosäuren an den Positionen 73, 76 und 77 in diesem Motiv substituiert. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Substitution des NLS2 an Position 76 keine wesentliche Rolle auf die Kernlokalisation von TWIST ausübt. Im Gegensatz dazu inhibieren die Substitutionen K73R und K77R die nukleäre Akkummulierung. Obgleich K76R-Mutanten die nukleäre Akkumulierung und Lokalisation nicht selbst hemmen können, konnte ich zeigen, dass sie eine synergistische Rolle mit der NLS1 K38R-Mutation übernehmen und die Akkumulierung und Lokalisierung im Kern weiter zu verringern. Dieser synergistische Effekt deckt sich mit der Beobachtung, dass kombinierte K38R-(NLS1)- und K76R-(NLS2)-Mutanten eine deutliche Verringerung der Lokalisation im Kern aufweisen. Außerdem lässt er vermuten, dass NLS1 und NLS2 bei der Regulierung der nukleären Lokalisation des TWIST-Proteins zusammenarbeiten. TWIST gehört zur Klasse B der bHLH Proteine, die dafür bekannt sind, mit Mitgliedern der Klasse A der bHLH-Transkriptionsfaktoren (einschließlich der Genprodukte von E12 und E47) stabile Heterodimere zu bilden. Deshalb wurde die subzellulare Lokalisation von NLS1 und NLS2 des TWIST-Proteins in den U2-OS Zellen nach Co-Transfektion mit E12 untersucht. Die Co-Transfektionen mit den Heterodimer-Partnern E12 und NLS1-mutiertes TWIST führten zu einer Kompensierung der Fehllokalisation. Das zweite Ziel meiner Arbeit war es, interagierende Proteine zu identifizieren, die die Funktionalität von TWIST beeinflussen können. Dies erfolgte mit einer Hefe-Zwei-Hybrid- Untersuchung. Ich wollte feststellen, ob das TWIST-Protein oder seine konservierten Motive mit anderen regulatorischen Proteinen interagieren, um seine transkriptionale Aktivität zu regulieren. Bei der Suche mit dem Beute-Plasmid, das die gesamte codierende Sequenz des TWIST1-Gens enthielt, wurde ein interessanter Kandidat gefunden, das SEF2-Genprodukt, das zur Klasse A der bHLH-Transkriptionsfaktoren zählt. Die direkte Interaktion von SEF2 mit TWIST wurde in einem Hefe-Paarungs-Nachweis verifiziert und dann in einer in vivo Untersuchung zur Rettung der NLS Funktion in U2-OS-Zellen bestätigt. Das Ergebnis zeigte, dass SEF2 mit dem TWIST-Protein ein Heterodimer bildet und im Nukleus co-lokalisiert. Desweiteren wurden die beiden hoch konservierten TWIST-Motive NSEEE und WR getrennt analysiert, um interagierende Proteine und deren Rolle in der Regulierung der transkriptionellen Aktivität von TWIST1 herauszufinden. Ich erzielte mehr als 1000 Hefeklone für das NSEEE-Motiv und 120 Hefeklone für das WR-Motiv. Ein weiteres Durchsuchen der Hefeklone lieferte einige erfolgsversprechende Proteinkandidaten als Interaktionspartner des NSEEE-Motifs, wie ETV5, SURF4, Spastin, Metalloproteinase 2 und „ARL-like Protein“. Im Gegensatz dazu konnte ich keine interessanten Interaktionspartner für das WR-Motiv ermitteln. Möglicherweise muss die bHLH-Domäne vorhanden sein, um WR-Interaktion mit anderen Proteinen zu vermitteln.