In vivo-Untersuchungen von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Nicotiana tabacum
Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind,...
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| Main Author: | |
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2005
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Änderungen der
Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die
in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder
Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind,
sollten mit verschiedenen in vivo-Methoden Hinweise auf den biochemischen
Reaktions-Mechanismus gesammelt werden. Hierzu wurden zum einen
intermolekulare Interaktionen einzelner CDPK-Domänen mit dem bereits in Hefe
etablierten Split-Ubiquitin (SplitUB) System in trans untersucht. Zum
anderen wurde das System auch für eine durch Agrobacterium tumefaciens
vermittelte, transiente Expression in der Tabak-Art Nicotiana benthamiana
weiterentwickelt und erfolgreich angewandt. Dabei konnte eine Interaktion
der Calmodulin-ähnlichen Domäne
(CLD) mit der autoinhibitorischen Junction-Domäne (J) der CDPK nachgewiesen
werden. Auch das System der "Bimolecular Fluorescence Complementation" wurde
für die transiente Expression in N. benthamiana weiterentwickelt und konnte
Interaktionen der N-terminalen Domänen (VKJ) mit der CLD nachweisen.
Aufgrund stärkerer Hintergrund-Fluoreszenz konnte diese Methode nur Hinweise
auf eine mögliche Stimulus-Abhängigkeit der Interaktionen liefern. Neben den
intermolekularen Wechselwirkungen wurden auch intramolekulare Interaktionen
und somit die Gesamt-Konformation von Proteinen analysiert. Die hierzu
verwendete Methode des "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) in
cis konnte eine Abhängigkeit der Konformation von der Struktur der
Junction-Domäne in planta nachweisen. Zudem wurde das SplitUB-System in cis
für die Anwendung in Pflanze weiterentwickelt.
Hiermit konnte durch Analysen mutierter Formen von NtCDPK2 eine Abhängigkeit
der Konformation von einer biologischen Funktionalität sowohl der
Kinase-Domäne als auch von J aufgezeigt werden. Ebenso spielte die
Calcium-Affinität der in der CLD lokalisierten EF-Hände eine zentrale Rolle.
Diese Ergebnisse vervollständigten ein in der Literatur diskutiertes
Aktivierungs-Modell für CDPKs. Aufgrund einer hohen Hintergrund-Abspaltung
des Reporters konnten jedoch keine Aussagen über schnelle, dynamische
Prozesse wie z.B. nach einer Stimulus-induzierten, transienten Aktivierung
des Enzyms getroffen werden. Das SplitUB-System wurde auch für
Untersuchungen von Licht-abhängigen Konformations-Änderungen am Beispiel des
Cryptochroms AtCRY2 aus Arabidopsis thaliana angewandt. Dieser UV-A- und
Blaulicht-Rezeptor ließ einen eindeutigeren Nachweis erwarten, da eine
konstante Aktivierung des Enzyms durch Lichteinstrahlung postuliert wird. Es
konnte in dieser Arbeit erstmals die Licht-abhängige Konformations-Änderung
eines Cryptochroms in vivo nachgewiesen werden. Das SplitUB-System erlaubte
es hierbei im Gegensatz zu Untersuchungen an NtCDPK2, auch reziproke und
dynamische Unterschiede nach Übergang in Dauerlicht- oder
Dauerdunkel-Bedingungen zu detektieren. |
|---|---|
| Physical Description: | 127 Pages |
| DOI: | 10.17192/z2006.0064 |