Chemoenzymatic and Template-Directed Synthesis of Bioactive Macrocyclic Peptides

Nonribosomal peptide synthetases (NRPS) are large multienzyme complexes, which simultaneously represent template and biosynthetic machinery for the production of structurally diverse peptidic products that feature high pharmacological and biological activities. A key determinant of nonribosomal pept...

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Main Author: Grünewald, Jan
Contributors: Marahiel, Mohamed (Prof.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2005
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Table of Contents: Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind Multienzymkomplexe, die gleichzeitig Templat und biosynthetische Maschinerie für die Herstellung strukturell diverser peptidischer Produkte mit oftmals bedeutender pharmakologischer und biologischer Aktivität repräsentieren. Ein Schlüsselfaktor für die Bioaktivität nichtribosomaler Peptide ist die makrozyklische Struktur vieler dieser Verbindungen. Makrozyklisierung wird durch Thioesterase- (TE-) Domänen im letzten Schritt der nichtribosomalen Synthese katalysiert. Diese Arbeit beschreibt die erste biochemische Charakterisierung einer TE-Domäne eines Streptomyceten: Die Thioesterase des kalzium-abhängigen Antibiotikums (CDA) von S. coelicolor. Diese Zyklase katalysiert die Ringbildung linearer Peptidylthioester, die auf einer zu CDA analogen Sequenz basieren. Hierzu wurde der natürliche Phosphopantethein-Kofaktor durch verschiedene Abgangsgruppen ersetzt. Die höchsten Zyklisierungsraten wurden für die Thiophenol-Abgangsgruppe erzielt. Chemische Reaktivität ist demnach für eine effiziente Enzym-Acylierung wichtiger als Kofaktorerkennung. Die CDA-Zyklase katalysiert die Bildung zweier regioisomerer Laktone durch konzertierten Angriff der benachbarten Reste Thr2 und Ser1 auf das C-terminale Trp11 des Acyl-Enzym-Intermediates. Um diese relaxierte Regioselektivität der CDA TE eingehender zu untersuchen, wurden Änderungen im Peptidrückgrat und der Fettsäure vorgenommen. Substitution von Thr2 oder Ser1 durch Alanin führte zur selektiven Bildung eines Dekapeptid- oder Undekapeptid-Ringes. Die Stereoselektivität der Zyklase blieb voll erhalten, und nur L-konfiguriertes Ser1 bzw. Thr2 wurde toleriert. Elongation der Fettsäure um vier Methyleneinheiten auf die natürliche Länge (C6) von CDA wandelte die relaxierte in eine strikte Regioselektivität um, was zur ausschließlichen Bildung des Dekapeptid-Laktons führte. Zudem wurde weniger Hydrolyse beobachtet. Diese Ergebnisse verdeutlichen den Einfluss der Fettsäure auf die Regio- und Chemoselektivität der TE-vermittelten Makrozyklisierung. CDA gehört, wie das klinisch zugelassene Antibiotikum Daptomycin, den sauren Lipopeptiden an. Um das Potential der CDA-Zyklase zur chemoenzymatischen Synthese von Daptomycin abschätzen zu können, wurden sukzessive sechs Daptomycin-spezifische Reste in lineare CDA-Undekapeptidyl-Thioester eingebaut. Alle sechs Substrate wurden durch die CDA TE zyklisiert. Gleichzeitiger Einbau aller sechs Reste in das CDA-Peptidrückgrat und Verlängerung des N-Terminus um zwei Reste führte schließlich zur Synthese eines Daptomycin-Analogons, dem nur die -Methylgruppe von L-3-Methylglutamat fehlte. In Übereinstimmung mit sauren Lipopeptiden war die Bioaktivität des chemoenzymatisch hergestellten Daptomycin-Derivats von der Anwesenheit von Kalzium abhängig. Um Kalzium-Bindungsstellen in dem Daptomycin-Analogon zu identifizieren, wurden sukzessive alle vier sauren Reste gegen Asn oder Gln ausgetauscht. Bioaktivitätstests wiesen die essentielle Bedeutung von Asp7 und Asp9 für die antimikrobielle Potenz nach. Zudem sind diese Reste in allen nichtribosomalen sauren Lipopeptiden und dem Kalzium-bindenden EF-Motiv ribosomal-hergestellten Calmodulins konserviert. Der letzte Teil dieser Arbeit beschreibt die Detektion von Peptidzyklisierung durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET). Hierbei werden der Donor Trp und der Akzeptor Kyn (Kynurenin) durch TE-Domänen-katalysierte Peptidzyklisierung räumlich so nahe zusammengebracht, das effizienter FRET ermöglicht wird. Die beiden Fluorophore konnten mittels Festphasensynthese in das Peptidrückgrat eingebaut werden und zeigen exzellente spektrale Überlappung zwischen Donor-Emission und Akzeptor-Absorption. Mittels dieser Methode konnte TE-vermittelte Zyklisierung in Echtzeit verfolgt werden. Zudem konnten Zyklopeptide im picomolaren Bereich detektiert werden, was kinetische Studien TE-katalysierter Makrozyklisierung erleichterte. Die generelle Anwendbarkeit FRET-unterstützter Detektion von Zyklopeptiden wurde für zwei Zyklasen gezeigt: Tyrocidin (Tyc) TE und CDA TE. Bei letzterer wurde diese Methode mit ortsgerichtetem Affinitätslabelling kombiniert, was neue Möglichkeiten für das Hochdurchsatz-Enzymscreening eröffnete.