Das tumortherapeutische Potential optimierter Agonisten der Rezeptoren des Apoptose-induzierenden Liganden TRAIL
Schader, Manuela
Trotz der Entwicklung neuer Wirkstoffen und verbesserter Therapien ist die Bekämpfung von Tumoren weiterhin eine große Herausforderung. Apo-2L oder „tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis ligand“ (TRAIL), TRAIL, ist ein Mitglied der TNF-Familie und ein vielversprechendes Protein für die Krebstherapie, weil es selektiv in transformierten, nicht aber in gesunden Zellen Apoptose induziert. Zudem scheint das TRAIL-System die Resistenz von vielen Tumoren gegenüber derzeitigen Behandlungs-Strategien, die im wesentlichen aus Chemotherapie und Bestrahlung bestehen, überwinden zu können.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zuerst rekombinante multimerisierte Einzelkettenantikörperfragmente mit den Spezifitäten anti-TRAIL-R2 und anti-CD95 (APO-1/Fas) hergestellt und charakterisiert. Aus Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper gegen TRAIL-R2 und CD95 produzieren, wurden nach RNA-Isolierung und cDNA-Synthese die für die variablen schweren und leichten Antikörperketten (VH und VL) kodierenden Gene mittels PCR amplifiziert. Die Herstellung der Expressionsvektoren erfolgte durch C-terminale Fusion der VH- und VL-Expressionskassetten an die Multimerisierungsdomäne eines modifizierten Leuzin-Zippers. Nach Transformation von E.coli mit den Expressionsvektoren und Expression der rekombinanten Proteine wurde die Spezifität und Aktivität der scFv-anti-TRAIL-R2- und scFv-anti-APO-1-Fragmente nach erfolgreicher in vitro Rückfaltung untersucht. Funktionelle Bindung von scFv-anti-TRAIL-R2-Antikörperfragmenten konnte auf TRAIL-R2-exprimierenden Tumorzellen durch FACS-Analyse nachgewiesen werden. Die lytische Aktivität des Antikörperderivates auf verschiedenen Tumorzellen war nur minimal. Im Falle des scFv-anti-APO-1-Antikörperfragmentes konnte sowohl Bindung, als auch zytotoxische Aktivität auf CD95-exprimierenden Tumorzellen gezeigt werden. Das agonistische Potential war jedoch nicht höher als beim Ausgangsantikörper anti-APO-1.
Zudem wurde in dieser Arbeit eine hochaktive rekombinante Form von TRAIL, IZ-TRAIL, entwickelt. Rekombinant in E.coli exprimiertes IZ-TRAIL konnte in großen Mengen durch sequentielle Affintitätschromatographie gereinigt werden. Hohe anti-tumorale Wirksamkeit von IZ-TRAIL als Einzeltherpeutikum sowie in Kombination mit Chemotherapeutika wurde auf zahlreichen Tumorzellen in vitro gezeigt. Trotz der hohen Wirksamkeit auf Tumorzellen, konnte keine Zytotoxizität in der Maus und auf frisch isolierten primären humanen Hepatozyten, auch in Kombination mit diversen Chemotherapeutika nachgewiesen werden. Mit IZ-TRAIL wurde eine TRAIL-Version entwickelt, die im Vergleich zu nicht getaggten TRAIL-Versionen eine hohe anti-tumorale Wirkung hat, und gleichzeitig für primäre Zellen nicht toxisch ist.
Philipps-Universität Marburg
Medical sciences Medicine
opus:1205
urn:nbn:de:hebis:04-z2005-05131
https://doi.org/10.17192/z2005.0513
Apoptose
https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2005/0513/cover.png
Medizin
Cancer
2011-08-10
2005-11-03
Tumortherapie
128
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Schader, Manuela
Schader
Manuela
Despite the development of new drugs and the improvement of therapies, the fight against cancer is still ongoing. Apo-2L or tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis ligand, TRAIL, is one of several members of the TNF family and due its selectivity towards transformed versus normal cells it bears the potential as a cancer therapeutic agent. Furthermore, the TRAIL system seems to circumvent the resistance of tumors induced by treatment with chemo- and radiotherapie.
In this study multivalent single chain antibody fragments (scFv fragments) specific for TRAIL-R2 and CD95 were generated and analysed. CDNA was prepared from isolated RNA of hybridoma cells expressing monoclonal antibody for TRAIL-R2 and CD95 (APO-1/Fas) and used for PCR amplification of heavy and light variable regions (VH and VL) genes. The VH and VL expression cassettes were C-terminally fused to a multimerisation domain of a modified leucine-zipper. The recombinant proteins were produced by transformation of E.coli with the generated expression leucine zipper plasmids. Specificity and activity of the in-vitro-refolded scFv-anti-TRAIL-R2 and scFv-anti-APO-1 antibody fragments have been evaluated. The specific binding of the scFv-anti-TRAIL-R2 fragment to TRAIL-R2 expressing tumor cells was confirmed by FACS analysis. Only minimal lytic activity of the scFv-anti-TRAIL-R2 fragment on a variety of tumor cells could be detected. In the case of the scFv-anti-APO-1 fragments, specific binding as well as lytic activity was observed. However, compared to the parental anti-APO-1 antibody the potential of this recombinant antibody was not increased.
In addition, a highly active recombinant version of TRAIL, IZ-TRAIL, was generated in this study. IZ-TRAIL was recombinantly in E.coli expressed and purified in large scale by sequential affinity chromatography. The anti-tumoral efficacy of IZ-TRAIL alone or in combination with different chemotherapeutic drugs was evaluated on a variety of tumor cells. Besides the high apoptosis-inducing activity on cancer cells, no toxicity in mice and on freshly isolated human hepatocytes of either IZ-TRAIL alone or in combination with diverse chemotherapeutic drugs was observed. Therefore, in contrast to non-tagged versions of TRAIL this recombinant IZ-TRAIL shows high activity against tumor cells and, at the same time, it is not toxic to primary cells.
monograph
Trotz der Entwicklung neuer Wirkstoffen und verbesserter Therapien ist die Bekämpfung von Tumoren weiterhin eine große Herausforderung. Apo-2L oder „tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis ligand“ (TRAIL), TRAIL, ist ein Mitglied der TNF-Familie und ein vielversprechendes Protein für die Krebstherapie, weil es selektiv in transformierten, nicht aber in gesunden Zellen Apoptose induziert. Zudem scheint das TRAIL-System die Resistenz von vielen Tumoren gegenüber derzeitigen Behandlungs-Strategien, die im wesentlichen aus Chemotherapie und Bestrahlung bestehen, überwinden zu können.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zuerst rekombinante multimerisierte Einzelkettenantikörperfragmente mit den Spezifitäten anti-TRAIL-R2 und anti-CD95 (APO-1/Fas) hergestellt und charakterisiert. Aus Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper gegen TRAIL-R2 und CD95 produzieren, wurden nach RNA-Isolierung und cDNA-Synthese die für die variablen schweren und leichten Antikörperketten (VH und VL) kodierenden Gene mittels PCR amplifiziert. Die Herstellung der Expressionsvektoren erfolgte durch C-terminale Fusion der VH- und VL-Expressionskassetten an die Multimerisierungsdomäne eines modifizierten Leuzin-Zippers. Nach Transformation von E.coli mit den Expressionsvektoren und Expression der rekombinanten Proteine wurde die Spezifität und Aktivität der scFv-anti-TRAIL-R2- und scFv-anti-APO-1-Fragmente nach erfolgreicher in vitro Rückfaltung untersucht. Funktionelle Bindung von scFv-anti-TRAIL-R2-Antikörperfragmenten konnte auf TRAIL-R2-exprimierenden Tumorzellen durch FACS-Analyse nachgewiesen werden. Die lytische Aktivität des Antikörperderivates auf verschiedenen Tumorzellen war nur minimal. Im Falle des scFv-anti-APO-1-Antikörperfragmentes konnte sowohl Bindung, als auch zytotoxische Aktivität auf CD95-exprimierenden Tumorzellen gezeigt werden. Das agonistische Potential war jedoch nicht höher als beim Ausgangsantikörper anti-APO-1.
Zudem wurde in dieser Arbeit eine hochaktive rekombinante Form von TRAIL, IZ-TRAIL, entwickelt. Rekombinant in E.coli exprimiertes IZ-TRAIL konnte in großen Mengen durch sequentielle Affintitätschromatographie gereinigt werden. Hohe anti-tumorale Wirksamkeit von IZ-TRAIL als Einzeltherpeutikum sowie in Kombination mit Chemotherapeutika wurde auf zahlreichen Tumorzellen in vitro gezeigt. Trotz der hohen Wirksamkeit auf Tumorzellen, konnte keine Zytotoxizität in der Maus und auf frisch isolierten primären humanen Hepatozyten, auch in Kombination mit diversen Chemotherapeutika nachgewiesen werden. Mit IZ-TRAIL wurde eine TRAIL-Version entwickelt, die im Vergleich zu nicht getaggten TRAIL-Versionen eine hohe anti-tumorale Wirkung hat, und gleichzeitig für primäre Zellen nicht toxisch ist.
opus:1205
Medizin
Medical sciences Medicine
Medizin
Drugs
doctoralThesis
TRAIL
Apoptosis
Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg
Universitätsbibliothek Marburg
Tumourtherapeutic potential of optimised receptor agonists of the apoptosis -inducing-ligand TRAIL
2005-11-22
2005
Onkologie
TRAIL
urn:nbn:de:hebis:04-z2005-05131
Agonisten
Philipps-Universität Marburg
ths
Prof. Dr.
Eilers
Martin
Eilers, Martin (Prof. Dr.)
ppn:134253965
German
https://doi.org/10.17192/z2005.0513
Das tumortherapeutische Potential optimierter Agonisten der Rezeptoren des Apoptose-induzierenden Liganden TRAIL
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