Energy-converting [NiFe] hydrogenases in archaea and bacteria: insights into the energy-transducing mechanism
In recent years a group of multisubunit membrane-bound [NiFe] hydrogenases has been identified in a variety of anaerobic or facultative anaerobic microorganisms. These enzymes share two conserved integral membrane proteins and four conserved hydrophilic proteins with the energy-conserving NADH:quino...
Main Author: | |
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Contributors: | |
Format: | Doctoral Thesis |
Language: | English |
Published: |
Philipps-Universität Marburg
2005
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Subjects: | |
Online Access: | PDF Full Text |
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In den letzten Jahren wurden Mitglieder einer Gruppe von membrangebundenen [NiFe]-Hydrogenasen mit deutlicher Sequenzverwandtschaft zu Untereinheiten von NADH:Chinon-Oxidoreduktasen (Komplex I) in verschiedenen anaeroben und fakultativ anaeroben Mikroorganismen identifiziert. Aufgrund physiologischer und biochemischer Untersuchungen wurde für verschiedene Mitglieder dieser Enzymfamilie eine Funktion als Ionenpumpe in energiekonservierenden Elektronentransportketten, eine Beteiligung am revertierten Elektronentransport, oder eine Beteiligung an beiden Prozessen, vorgeschlagen. Aus diesem Grund wurden diese Enzyme als energiekonvertierende [NiFe]-Hydrogenasen bezeichnet. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Energiekopplung in energiekonvertierenden Hydrogenasen im Vergleich zu Komplex I untersucht. Ein Schwerpunkt wurde dabei auf die Charakterisierung der am Elektronentransfer beteiligten prosthetischen Gruppen, die Funktion des Membranteils des Enzyms und die Identifizierung des Kopplungsions dieser Enzyme, gelegt. Die meisten Experimente wurden mit Ech-Hydrogenase aus Methanosarcina barkeri durchgeführt. Aus der Primärstruktur von Ech-Hydrogenase kann die Bindung von drei [4Fe-4S]-Zentren, eines in Untereinheit EchC und zwei in Untereinheit EchF, vorhergesagt werden. Frühere Studien hatten gezeigt, dass zwei dieser Eisen-Schwefel-Zentren bei pH 7 und unter 1 bar H2 vollständig reduziert vorliegen und zwei distinkte EPR Signale, die als g = 1.89 Signal und g = 1.92 Signal bezeichnet wurden, hervorrufen. Redox-Titrationen bei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Mittelpunktspotentiale dieser Eisen-Schwefel-Zentren pH-abhängig sind. Dies deutet auf eine Beteiligung dieser Zentren am Ionentransfer hin. Um diese EPR Signale den Untereinheiten des Enzyms zuzuordnen, wurden verschiedene M. barkeri Mutanten hergestellt, in denen sieben der acht konservierten Cysteinreste der Untereinheit EchF jeweils durch Serin ersetzt wurden. Eine Charakterisierung der gereinigten Mutantenenzyme mittels EPR Spektroskopie zeigte eine starke Reduktion bzw. ein völliges Fehlen des g = 1.92 Signals, während das g = 1.89 Signal in fünf der Mutantenenzyme noch als Hauptsignal identifiziert werden konnte. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte das g = 1.89 Signal dem proximalen Eisen-Schwefel Zentrum der Untereinheit EchC und das g = 1.92 Signal einer der beiden Untereinheiten der Untereinheit EchF zugeordnet werden. Die pH-Abhängigkeit des Mittelpunktspotentials dieser beiden [4Fe-4S]-Zentren deutet darauf hin, dass diese Zentren sowohl am Elektronen- als auch Ionentransport beteiligt sind und damit möglicherweise einen wichtigen Teil der Ionenpumpe darstellen. Die beiden integralen Membranuntereinheiten von Ech Hydrogenase, EchA und EchB, tragen mehrere Glutamat- oder Aspartatreste, die sowohl in anderen Energie-konvertierenden Hydrogenasen als auch in Komplex I hoch konserviert sind. Diese Reste könnten Teil eines transmembranen Ionenkanals sein. Übereinstimmend hiermit konnte gezeigt werden, dass Ech Hydrogenase durch das Carboxylgruppen-modifizierende Reagenz N, N’-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD) gehemmt wird. [14C]DCCD wurde spezifisch in die beiden hydrophoben Untereinheiten EchA und EchB eingebaut. Die Inaktivierung des Enzyms korrelierte hierbei insbesondere mit dem Einbau von [14C]DCCD in EchA. Mittels einer Kombination aus FT-IR Differenzspektroskopie und Elektrochemie konnte gezeigt werden, dass der durch Ech-Hydrogenase katalysierte Elektronentransfer eine Konformationsänderung des Enzyms als auch eine Protonierung von Aminosäureseitengruppen induziert. Ox-red Differenzspektren im mittleren Infrarotbereich (1800 bis 1200 cm-1) zeigten insbesondere eine Konformationsänderungen im Amid I Bereich. Ein Signal bei 1720 cm-1 wurde Aspartat oder Glutamat Seitengruppen zugeordnet, die im oxidierten Zustand protoniert vorliegen. Um das Kopplungsion energiekonvertierender Hydrogenasen zu identifizieren, wurden Untersuchungen an Carboxydothemus hydrogenoformans durchgeführt. Zellsuspensionen dieses Bakteriums koppeln bei pH 5,9 die Umsetzung von CO zu CO2 und H2 mit der Translokation von Protonen über die Cytoplasmamembran. Die transiente Ansäuerung des Mediums wurde durch das Protonophor CCCP, jedoch nicht durch das Natriumionophor ETH-157 gehemmt, was auf die Bildung einen primären elektrochemischen Protonengradienten hindeutet. Bei pH 6,7 konnte hingegen keine Protonentranslokation, gekoppelt an CO-Oxidation, beobachtet werden. Bei neutralem pH-Wert wurde jedoch eine Translokation von Natrium-Ionen beobachtet. Diese Reaktion war Protonophor-insensitiv, was auf eine primäre Natrium-Ionen Translokation hindeutet. Die Daten legen nahe, dass Coo Hydrogenase aus C. hydrogenoformans eine primäre Natrium-Ionen Pumpe ist, die bei niedrigen pH-Werten auch Protonen als Substrat verwendet.