Fachbereich Pharmazie application/pdf Pulmonary Inhalt dieser Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung verschiedener polymer- und lipid-basierter nanopartikulärer Formulierungen mit dem Ziel, diese bei der inhalativen Behandlung von Lungenerkrankungen einzusetzen zu können. Eine Reihe von Polyethyleniminen (PEI) wurde auf ihre Verwendbarkeit als nicht-virale biokompatible DNA- Transporter für eine Lungen-Gentherapie untersucht (Kapitel 2-5). Eine weitere Studie (Kapitel 6) verfolgte das Ziel Liposomen zu entwickeln, die für eine kontrollierte Wirkstofffreigabe nach Inhalation geeignet sind. Die Untersuchungen des Kapitels 2 stellen in dieser Dissertation, die Grundlage der Evaluierung von PEI als inhalierbare DNA Transporter zu dienen, dar. Es wurden vier verschiedene PEI-Modifikationen (verzweigtes, lineares, bioabbaubares + Polyethylenglycol-modifiziertes PEI) ausgewählt, die mit plasmidischer DNA (pDNA) Partikel in der Größenordnung von ca. 100 nm formten. Diese so genannten Polyplexe wurden hinsichtlich ihrer strukturellen und physikochemischen Veränderung während der Vernebelung mit einem Düsen- bzw. einem Ultraschallvernebler charakterisiert. Für diese Untersuchungen fanden verschiedene Techniken Anwendung, wie die Rasterkraftmikroskopie, die dynamische Lichtstreuung und die Laser Doppler Anemometrie. Damit konnten die Parameter Polyplex-Morphologie, Größe bzw. Zeta-Potential vor und nach den Vernebelungen bestimmt werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass die PEI Modifikationen, die am stärksten die pDNA komplexierten, die geringsten Veränderungen während der Vernebelung erfuhren. Dabei hatte das Polyethylenglycol-PEI (PEGPEI) die besten Eigenschaften hinsichtlich, DNA Komplexierung und Schutz bei der Vernebelung. Ein Vergleich der beiden Verneblersysteme ergab, dass alle Polyplexe am stabilsten während der Ultraschallverneblung waren. Als Schlussfolgerung dieser Studie, stellten wir die Ultraschall-Vernebelung als die geeignetere Methode für die Verabreichung von PEI-basierten Gentransfersystemen in die Lunge heraus. Des Weiteren sind die guten Stabilitätseigenschaften des PEGPEI hervorzuheben, auf Grund dessen wir in den darauf folgenden Studien PEGPEI als Vektor, neben dem Standartvektor verzweigtes 25 kDa PEI (BPEI), für die Pulmonale DNA Applikation verwendeten. Das Ziel der zweiten Studie (Kapitel 3) war die Entwicklung eines biokompatiblen und effizienten Systems für den Gentransport in die Lungen Epithelzellen. Dafür wurden zwei PEI Modifikationen verwendet, ein niedermolekulares PEI (LMWPEI) und das schon beschriebene PEGPEI, die mit dem Standart-Vektor BPEI verglichen wurden. Die Untersuchungen der Polyplex Morphologie (Rasterkraftmikroskopie), Größe (Dynamischer Lichtstreuung) und Zeta-Potential (Laser Doppler Anemometrie) zeigten, dass alle drei Polymere die pDNA vollständig kondensierten und mit dieser kleine, positiv geladene Partikel von ca. 100 nm formten. Zur Untersuchung der Polymer-Toxizität in vitro wurden MTT- und LDH-Assays durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass das LMWPEI die beste Biokompatibilität aufweist. Die Transfektionseffizienz der drei verschiedenen Vektoren wurde in vitro an einer Lungenepithelzelllinie und in vivo in Mäuselungen nach intratrachealer Instillation untersucht. Dabei wurde für LMWPEI im Vergleich zu BPEI und PEGPEI in vitro die geringste Genexpression detektiert, während die Transfektionsrate in der Mäuselunge für das LMWPEI am höchsten war. Interessanterweise beobachteten wir für PEGPEI ein genau gegensätzliches Verhalten und die sehr hohe Genexpression in der Zellkultur konnte in den Tierversuchen nicht reproduziert werden. Auf Grund dieser Beobachtungen stellten wir die Hypothese auf, dass eine gute Stabilität der Polyplexe im Mucus, im Surfactant und im Zellplasma, die Transfektion in vivo verändern könnten. Um dies zu untersuchen, wurden die Polyplexe mit Lavagen von Mäuselungen und mit natürlichem Surfactant inkubiert. Es konnte eine abnehmende Stabilität der Polyplexe in der Reihenfolge: PEGPEI ] BPEI ] LMWPEI beobachtetet werden. Daraus schlussfolgerten wir, dass starke Wechselwirkungen zwischen dem Polymer und der DNA in vivo zu einer schlechteren Freigabe der DNA führt und somit die Transfektionseffizienz verringert. Die Ergebnisse der Studie in Kapitel 3 zeigten, dass mittels LMWPEI im Tiermodel ein biokompatibler und effizienter Genvektor für die Lungentherapie entwickelt werden konnte. Diese viel versprechenden Ergebnisse gaben Anlass zu weiterführenden Studien über die Verträglichkeit von LMWPEI in der Mäuselunge (Kapitel 4). Dazu wurden die Polyplexe von LMWPEI im Vergleich zu BPEI und PEGPEI via Instillation in die Mäuselunge verabreicht und nach 48 Stunden wurden die Lungen lavagiert. Diese Lavagen wurden dann hinsichtlich Entzündungsfaktoren wie Gesamtzellzahl, Anzahl der Neutrophilen und der Makrophagen, Konzentration der Gesamtproteine und der Zytokine untersucht. Dabei wurden sowohl für die pDNA als auch die Polyplexe erhöhte Werte gemessen, diese konnten eingestuft werden in leichte Entzündungen bei der DNA und LMWPEI/DNA, mittlere Lungenentzündung bei BPEI/DNA und starke Lungenentzündung bei PEGPEI/DNA. Die Betrachtung dieser Ergebnisse im Zusammenhang mit den Transfektionsraten führte uns zu der Schlussfolgerung, dass mit zunehmender Toxizität in der Mäuselunge (LMWPEI [ BPEI [ PEGPEI) die Transfektionseffizienz (LMWPEI ] BPEI ] PEGPEI) abnimmt. Folglich wählten wir das LMWPEI für weitergehende Versuche zur Aerosolapplikation in die Lunge aus. Dafür entwickelten wir ein neues Inhalationssystem für Mäuse. Bedauerlicherweise nahmen die Transfektionsraten von LMWPEI/DNA nach der Vernebelung im Vergleich zur Instillation um den Faktor 50 ab. Um den Grund für diese drastische Abnahme zu erkunden, stellten wir Polyplexe her, bei denen sowohl die pDNA als auch das LMWPEI fluoreszenzmarkiert waren und verglichen deren Lungenverteilung nach Instillation mit der nach Inhalation. In den Konfocale Fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der Lungenschnitte zeigte sich, dass die vernebelten Polyplexe gleichmäßig in der Lunge verteilt waren, jedoch in sehr geringen Mengen. Im Gegensatz dazu waren die Polyplexe nach der Instillation in sehr hohen Konzentrationen sowohl in den Bronchien als auch in den Alveolen vorhanden, jedoch wurden nicht alle Abschnitte der Lunge erreicht. Des Weiteren beobachteten wir erstmalig, dass LMWPEI/DNA auch in die Lungenendothelzellen aufgenommen wurde. Zusammenfassend ergibt sich, dass LMWPEI ein sehr effizienter sowie biokompatibler Genvektor für die Lungentherapie ist, und diesbezüglich auch viel bessere Eigenschaften als das häufig eingesetzte BPEI aufweist. In einer weiteren Studie (Kapitel 5) ist die Entwicklung eines neuen Genvektors beschrieben, der mit einem TAT-Peptid (eine Proteintransduktionsdomaine) modifiziert wurde. Dazu wurde das TAT Peptid an BPEI über eine PEG-Kette kovalent gebunden. Dieses neue PEI Konjugat wurde, wie schon die zuvor beschriebenen Vektoren, hinsichtlich Kondensation der pDNA, Schutz der pDNA im extra- und intrazellulärem Lungenmilieu, Polyplexgröße, Stabilität, Zeta-Potential, in vitro und in vivo Transfektionseffizienz sowie Toxizität und Verteilung der Polyplexe in der Mäuselunge untersucht. Unser Ziel war es gewesen, einen nicht toxischen und sehr effizienten Genvektor zu entwickeln. Dies konnte mit dem neuem TAT-PEG-PEI weitgehend erreicht werden. Dieses Konjugat war in der Lage, sehr kleine und stabile Partikel mit pDNA zu formen. In der Mäuselunge wurde für die TAT-PEG-PEI Polyplexe ein Anstieg der Genexpression von ~600 % im Vergleich zu BPEI und ~300 % im Vergleich zu LMWPEI beobachtet. Weiterhin konnten wir eine hervorragende Verträglichkeit in vivo feststellen, und die Werte der Indikatoren eine Entzündungsrektion lagen im Bereich derer von pDNA. Ein weiterer Vorteil von TAT-PEG-PEI war der sichere Transport der pDNA in die verschiedenen Zellentypen der Lunge. Aus diesem Grund könnte dieser neu Genvektor für die Behandlung verschiedener Lungenerkrankungen eingesetzt werden, bei der verschiedenste Zelltypen betroffen sind, wie z.B. beim Lungenkrebs. Das wichtigste Ergebnis dieser vier beschriebenen Studien ist, dass TAT-PEG-PEI undim geringerem Maße auch LMWPEI als gut verträgliche und effiziente Vektoren das Potential besitzen, in der Gentherapie verschiedener Lungenerkrankungen Anwendung zu finden. Selbstverständlich sind weitergehende Studien notwendig, um die zwar geringe aber doch vorhandene Toxizität der Polyplexe weiter zu reduzieren. Dieses Ziel könnte beispielsweise erreicht werden, indem man für die Synthese von TAT-PEG-PEI das LMWPEI oder ein hochsubstituiertes PEGPEI verwendet. Des Weiteren sollte die Aufnahme von TAT-PEG-PEI Polyplexen in die Zelle genauer untersucht werden, da bisher widersprüchliche Studien über die Aufnahme und den Weg des TAT Peptides in der Zelle existieren. Weitergehende Studien hinsichtlich zellspezifischer Genvektoren sollten durchgeführt werden. Es wäre z.B. möglich, das LMWPEI mit einer zielgerichteten Struktur zu modifizieren, wie z.B. Lectin, Folat, einem Antikörper oder Peptiden wie z.B. das RGD. Der nächste Schritt sollte dann darin bestehen, therapeutische Gene (IL-12, p53, NO oder Prostacyclin Produzenten) mittels der optimierten Vektoren TAT-PEG-PEI und LMWPEI in die Lungenzellen zu transportieren. Des Weitern sollte versucht werden, das Vernebelungssystem für die in vivo Versuche zu verbessern, z.B. durch einen so genannten „Trocknenden Spacer“, wie er kürzlich von Rudolph et al. (2005) beschrieben wurde. Die fünfte Studie dieser Arbeit (Kapitel 6) beschreibt lipid-basierte Formulierungen als inhalierbare Drug Delivery Systeme. Der Wirkstoff Iloprost ist zugelassen in der Aerosoltherapie der Arteriellen Pulmonalen Hypertonie. Jedoch ist die Wirksamkeit dieses Stoffes begrenzt durch seine kurze Halbwertszeit. Infolgedessen war das Ziel der Studie die Entwicklung einer Formulierung, die Iloprost über einen verlängerten Zeitraum freisetzt. Solch eine Formulierung sollte beides gewährleisten: eine hohe Wirkstoffverkapselung und Stabilität während der Vernebelung. Dazu wurden verschiedene Lipidkombinationen für die Herstellung von Liposomen untersucht. Zuerst wurde die Modellsubstanz Carboxyfluorescein in Liposomen verkapselt, die aus Dipalmitoyl-phosphatidylcholin (DPPC) und Cholesterol (CH), oder aus DPPC, CH und PEG-dipalmitoyl-phoshatidylethanolamine (DPPE-PEG), bestanden. Die Stabilität dieser Liposomen wurde an drei verschiedenen Verneblern untersucht: Düsen-, Ultraschall- und Mikropumpenvernebler. Diese Systeme wurden hinsichtlich der Menge an produziertem Aerosol, der Aerosoltropfengröße und deren Einfluss auf die Liposomen verglichen. Dabei wurde die Stabilität der Liposomen in Bezug auf Liposomengröße und der Wirkstoffverkapselung, jeweils vor und nach der Vernebelung beurteilt. Es stellte sich heraus, dass die DPPC/CH Liposomen am stabilsten waren, insbesondere nach der Vernebelung mit dem Ultraschall- und dem Mikropumpenverneblern. In einer zweiten Versuchsreihe wurden die Liposomen mit Iloprost beladen. Dabei wurde die höchste Stabilität und Verkapselungseffizienz ebenfalls für die DPPC/CH Liposomen vor allem nach der Mikropumpenverneblung gefunden. Demzufolge schlussfolgerten wir, DPPC/CH Liposomen sind als eine Formulierung mit verlängerter Wirkstofffreigabe in der Behandlung der pulmonalen Hypertonie gut geeignet. Bis dieses Ziel erreicht werden kann, sind jedoch noch viele weiterführende Untersuchungen notwendig, und die hier präsentieren Ergebnisse stellen erst den Grundstein dafür dar. Als nächste Schritte sollten die Aufnahme der Liposomen in Lungenepithelzellen bzw. die Wirkstofffreisetzung untersucht werden, gefolgt von pharmakokinetischen ex vivo Studien. Danach sollte die Wirksamkeit der Iloprost-Liposomen an einem Tiermodel untersucht werden, bei dem, z.B. ausgelöst durch die Haltung in Hypoxie, eine pulmonale Hypertonie besteht. Die neuen Formulierungen und Technologien, die in dieser Dissertation beschrieben sind, stellen zwar nur einen kleinen, aber dennoch wichtigen Fortschritt in der Entwicklung von neuen Therapieformen für die Behandlung von Lungenerkrankungen dar. Derartige Formulierungen geben Anlass zur Hoffnung eines Tages die Behandlung von schwerkranken Patienten deutlich zu verbessern. Polykation E. Kleemann, L. A. Dailey, H. G. Abdelhady, et al. Modified polyethylenimines as non-viral gene delivery systems for aerosol gene therapy: Investigations of the complex structure and stability during air-jet and ultrasonic nebulization. J Control Release 100: 437-450 (2004). monograph Polyethylenimine- and lipid- based nanoparticles as gene and drug delivery systems for aerosol therapy to the lung 2005-07-25 Pulmonale Hypertonie Aerosol 2005 2011-08-10 Nebulization https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2005/0363/cover.png Medical sciences Medicine Medizin urn:nbn:de:hebis:04-z2005-03638 Gentherapie Nanopartikel ths Prof. Dr. Kissel Thomas Kissel, Thomas (Prof. Dr.) Philipps-Universität Marburg ppn:132956837 Lipide Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie opus:1073 Polyethylenimine Liposome Inhalationstherapie Kleemann, Elke Kleemann Elke Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg English Gene therapy Inhalation This thesis describes the development and characterization of a variety of polymeric and liposomal drug delivery systems for use in pulmonary aerosol therapy. A variety of polyethylenimines (PEIs) were studied in depth in an attempt to develop biocompatible gene vectors for efficient non-viral gene therapy for the lung (Chapter 2-5). Another study (Chapter 6) investigates a number of lipid-based nanoparticles that were specifically designed to act as sustained release formulations for pulmonary drug delivery. The investigations presented in Chapter 2 form the foundations of this thesis by evaluating the general suitability of PEI as a gene vector in an aerosol therapy. Four different PEI modifications (branched, linear, polyethylenglycol-grafted and biodegradable PEI) copolymer were utilized as carriers for plasmid DNA (pDNA), with the resulting polyplexes displaying diameters of approximately 100 nm. These were extensively characterized with respect to identifying any structural and/or physico-chemical alterations that occurred during aerosolization with both air-jet and ultrasonic nebulizer. A number of techniques including atomic force microscopy (AFM), dynamic light scattering (DLS) and laser Doppler anemometry (LDA) were employed to determine the various morphologies, diameters and zeta-potentials of the polyplexes pre- and post-aerosolization. The PEI modifications and displaying stronger DNA condensation were shown to form more stable polyplexes, due to the reduced level of damage observed post- aerosolization. The poly (ethylene glycol) PEI copolymer (PEGPEI) was shown to have the superior carrier properties regarding DNA condensation and protection. Furthermore, our results suggested that improved stability for PEI/DNA polyplexes can be attained using the ultrasonic nebulizer in preference to the air-jet apparatus. Thus, we concluded that ultrasonic nebulization is a milder aerosolization method for PEI-based gene delivery systems. Additionally, PEGPEI appeared to display the most promising properties as a pulmonary gene carrier, due to its stability. Therefore, we decided to employ the PEGPEI copolymer in addition to the commonly used branched 25 kDa PEI (BPEI) in the subsequent studies. Our primary aim in Chapter 3 was the development of a gene vector that achieves both high transgene expression and biocompatibility in the pulmonary epithelium. To accomplish this aim, a low molecular weight (5 kDa) PEI (LMWPEI) and a PEGPEI copolymer were employed as pDNA vectors and compared with the commonly utilized BPEI. Investigations of the polyplex morphologies (using AFM), sizes (by DLS) and zeta-potentials (using LDA) revealed that all three polymers are able to condense pDNA, forming small, positively charged particles of approximately 100 nm diameter. Cytotoxicity studies, performed using the MTT- and LDH-assay, indicated LMWPEI had the superior biocompatibility of the three polymers investigated. The transfection efficiencies of the three polyplexes were studied both in vitro (cell cultured lung epithelia) and in vivo (intratracheally instillation to the mouse lung). Whilst LMWPEI polyplexes were shown to be inefficient in transfecting lung epithelial cells in vitro, they caused the highest transfection rate in the mouse lung. Interestingly, the opposite behaviour was observed when PEGPEI polyplexes were investigated, with a high gene expression in vitro not being reproduced in vivo. We hypothesized that the polyplexes relative stability in the lung environment might explain this observation. In order to investigate the polyplex stability, natural lung lining fluid and lung surfactant were utilized, and a decreasing trend of DNA encapsulation in the order: PEGPEI ] BPEI ] LMWPEI was observed. Therefore, we concluded that stronger interactions between the carrier and the pDNA may hinder the DNA release under in vivo conditions, thus reducing the transfection efficiency. Our results indicated that LMWPEI fulfils the key requirements of low cytotoxicity and high gene expression in the mouse lung. Based upon the promising results of Chapter 3 the biocompatibility of LMWPEI/DNA in the mouse lung was further investigated, and the results are presented in Chapter 4. Polyplexes were applied via instillation, and after 48 hours lung lavages were performed. The bronchial alveolar lining fluid (BALF) obtained was subsequently investigated for total cell counts, quantity of neutrophils and macrophages as well as total protein and cytokine concentrations. These parameters are hallmarks of acute lung inflammation, and increased values were observed for all investigated systems in comparison to the control mice. In the case of pDNA and LMWPEI/DNA, only minor alterations were detected whereas BPEI/DNA caused stronger inflammation and surprisingly PEGPEI/DNA led to the most severe inflammation. When considering these findings together with the transfection results obtained in vivo (Chapter 3), we concluded that increasing cytotoxicity in the mouse lung (LMWPEI [ BPEI [ PEGPEI) causes decreasing transfection efficiency (LMWPEI ] BPEI ] PEGPEI). As such, LMWPEI was chosen as our preferred pDNA carrier for inhalation therapy. In parallel to this work, we developed a novel aerosol inhalation device for mice. Unfortunately, the transfection rate in the mouse lung decreased dramatically post- LMWPEI/DNA aerosolization in comparison to the instilled polyplexes. In an attempt to identify the reasons for this failure, we employed double-labeled polyplexes in order to compare the lung distribution of inhaled versus instilled polyplexes. The nebulized LMWPEI polyplexes were shown to be uniformly localized throughout the mouse lung in small quantities. In contrast, the instilled polyplexes were detected in much higher concentrations, in bronchial and alveolar regions, but were not evenly distributed. Interestingly, polyplexes were observed in epithelial and endothelial cells. Consequently, LMWPEI represents a highly efficient and biocompatible gene vector for the lung and is superior to the more commonly used BPEI. Another study (Chapter 5) describes the development and characterisation of a novel gene vector that is based upon BPEI covalently linked to a TAT peptide (a protein transduction domain) via a PEG spacer. The oligopeptide TAT was chosen to enhance cell uptake into lung cells, since reports had demonstrated high translocation ability of TAT by direct crossing biological membranes. In keeping with the two previous studies, the TAT-PEG-PEI conjugate was extensively investigated in terms of DNA condensation, DNA protection in the intra- and extracellular lung environment, polyplex size, stability, zeta-potential, in vitro and in vivo toxicity, transfection efficiency and polyplex distribution in the mouse lung. Since our key aim had been to develop a non-toxic, highly efficient carrier for the epithelial cells of the conducting and respiratory airways, this new carrier fulfilled the majority of our requirements. It was able to form very small and stable particles with pDNA. A ~600% improved gene expression in the mouse lung was observed for TAT-PEG-PEI polyplexes in comparison to BPEI and a ~300% improved gene expression in comparison to LMWPEI. Furthermore, only minor effects upon the lung function were observed, with no additional inflammation compared to pDNA instillation alone. A particular advantage of this carrier is its ability to transport DNA safely into the different cell types of the lung. Hence, it could be employed in the treatment of pulmonary diseases that attack the entire lung, such as lung cancer. Consequently, the TAT-PEG-PEI conjugate and to a lower extend also LMWPEI represent promising new approaches in pulmonary gene therapy of various lung disorders. Further work is necessary to decrease the cytotoxicity to a level where no inflammation is observed. This might be achieved by using either a highly branched PEGPEI copolymer or a LMWPEI in place of BPEI for the synthesis of TAT-PEG-PEI. Since a number of recent studies have reported conflicting results regarding the cellular uptake and pathway of TAT peptides, a study should be performed in order to track the pathway of TAT-PEG-PEI polyplexes into the cells and nucleus. Further work should focus on the development of a cell specific gene vector for pulmonary gene therapy. In this respect, the synthesis of LMWPEI modifications carrying target moieties such as lectin, folate, peptides (e.g. RGD) or antibodies would be of particular interest. The next major set of experiments should focus on the delivery of therapeutic genes such as IL-12, p53, prostacyclin or nitric oxide synthase, via optimized TAT-PEG-PEI or LMWPEI vehicles. Additionally, the challenge of efficient polyplex administration to mice via aerosol inhalation remains. Improvements of the nebulization system developed here may be achieved by employing a so called ‘drying spacer’, a development recently reported by Rudolph et al. Currently the drug iloprost is approved for the aerosol therapy of pulmonary hypertension. However, the effectiveness of this formulation is limited by the short half live of iloprost in vivo. As such, the aim of the study presented in Chapter 6 was to develop a sustained releasing formulation for iloprost. A variety of lipid combinations were studied in order to find a formulation that accomplish both, encapsulate high quantities of iloprost and is stable throughout the aerosolization process. Initially, the model drug Carboxyfluorescein was encapsulated in liposomes consisting of Dipalmitoyl-phosphatidylcholin (DPPC) and Cholesterol (CH), or DPPC, CH and PEG-dipalmitoyl-phoshatidylethanolamine (DPPE-PEG). Liposomal morphology was studied using AFM and the liposome phase transition temperatures were investigated using differential scanning calorimetry. Their stability during aerosolization was investigated using air-jet, ultrasonic and micro pump nebulizers. These nebulizers were compared in terms of mass output, aerosol droplet size and their effects upon the liposome stability. Regarding liposome size and drug loading pre- and post-nebulization, the DPPC/CH liposomes were shown to be the most stable formulation, particularly during ultrasonic and micro pump nebulization. In a second study, Iloprost-loaded liposomes were prepared and we were able to show that the DPPC/CH liposomes again displayed the highest encapsulation efficiency and stability during ultrasonic and micro pump nebulization. We concluded that DPPC/CH liposomes are well suited to act as a sustained release formulation for the treatment of pulmonary hypertension. This study highlights the clear possibilities that exist for the development of a pulmonary sustained release formulation for the treatment of pulmonary hypertension. The next steps would focus on drug release and cellular uptake studies in lung epithelial cells, followed by pharmacokinetic studies in an ex vivo animal model. The effectiveness of the liposomal iloprost formulation should be further investigated by employing an animal pulmonary hypertension model, e.g. holding mice under hypoxia conditions. The novel approaches and technologies described in this thesis represent small but important advances in the application of aerosol therapy to the treatment of acquired diseases. Hopefully formulations similar to those described here will one day offer significantly improved treatments for people suffering from a range of illnesses. doctoralThesis 2005-05-25 https://doi.org/10.17192/z2005.0363