Transcription factor Sp3 as target for SUMOylation in vivo

A group of sequence-specific DNA-binding proteins related to the transcription factor Sp1 (specificity protein 1) has been implicated in the regulation of many different genes, since binding sites for these transcription factors (GC/GT boxes) are a recurrent motif in regulatory sequences of these ge...

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Main Author: Rischitor, Grigore
Contributors: Renkawitz-Pohl, Renate (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2005
Subjects:
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Table of Contents: Bei einer Gruppe von sequenzspezifischen DNA-Bindeproteinen, die mit dem Transkriptionsfaktor Sp1 (Specificity Protein 1) verwandt sind, wird eine Beteiligung an der Regulation verschiedener Gene vermutet, da die Bindestellen dieser Transkriptionsfaktoren (GC/GC-Boxen) ein wiederkehrendes Motiv in regulatorischen Sequenzen von Genen darstellen. Im Gegensatz zu den transkriptionellen Aktivatoren Sp1 und Sp4 kann das ubiquitär exprimierte Sp3 die Transkription sowohl aktivieren, als auch reprimieren. Die komplexe Aktivität von Sp3 ist abhängig von zwei glutamin-reichen Aktivierungs-Domänen, ähnlich denen von Sp1 und Sp4, sowie von einer neben den Aktivierungs-Domänen liegenden inhibitorischen Domäne, die nur in Sp3 gefunden wurde. Der kritische Lysin-Rest in der inhibitorischen Domäne von Sp3 liegt innerhalb einer Konsensus-Sequenz, welche das Ziel für die SUMOylierung des Proteins darstellt. SUMO (small ubiquitin-related modifier) wird in einem Mehrschrittprozeß analog der Ubiquitinierung über eine Isopeptid-Bindung mit einem Lysin-Rest des Zielproteins kovalent verknüpft. In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Aspekte der SUMO-Konjugation an Sp3 in vivo analysiert. Die Immunoblot-Analyse deckte die Existenz vier verschiedener Isoformen auf: zwei im Gel langsam migrierende Formen mit einem Molekulargewicht über 100 kDa, sowie zwei schnell migrierende Formen. Es erschienen sieben bis acht Sp3-Banden, wenn die Zellen unter speziellen Bedingungen lysiert wurden. Die hier zusätzlichen Banden stellen die SUMOylierten Isoformen dar. Eine deutliche Verschiebung zu den langen Isoformen konnte in Sp1-/- ES-Zellen beobachtet werden, was darauf hindeutet, daß die Expression der verschiedenen Sp3 Isoformen in vivo veränderbar ist. Außerdem läßt diese Beobachtung die Vermutung zu, daß die langen Isoformen von Sp3 die Funktionen von Sp1 unter Sp1-defizienten Bedingungen übernehmen. Bei der Überexpression von Sp3 sowie SUMO1 und SUMO2 in vivo erfolgte die Bindung beider SUMO-Proteine an Sp3 mit ähnlicher Effizienz. Neben dem Lysin-Rest an Stelle 551 innerhalb der inhibitorischen Domäne gibt es noch zwei weitere potentielle SUMOylierungsstellen in Sp3 (VKQE an Position 9 und IKDE an Position 120). Die vorligende Studie hat gezeigt, daß die SUMOylierung nur an K551 stattfindet, die in allen vier Isoformen vorhanden ist. Die Visualisierung des endogenen Sp3 mit Hilfe der Immunfluoreszenz zeigte eine schwamm-ähnliche, diffuse Erscheinung, hauptsächlich im Nukleus lokalisiert. Die Überexpression eines Fusionsproteins aus SUMO1 und GFP (green fluorescent protein) führte zur Akkumulierung dieses Fusionsproteins in subnuclearen PODs (promyelocytic leukemia oncogenic domains), während endogenes Sp3 weiterhin eine diffuse Verteilung im Nukleus zeigte. Die Wildtyp-Sp3 Isoformen und die Sp3 SUMOylierungs-defizienten Mutanten sind ebenfalls schwamm-ähnlich und diffus im Nukleus verteilt. Die Analyse der Sp3-Expression in verschiedenen Zelllinien und Mausorganen zeigte, daß das Ausmaß der Sp3-Modifikation mit SUMO nicht zelllinien- bzw. organspezifisch ist. Außerdem führten Serum-Entzug, Serum-Induktion und Hitzeschock zu keinerlei Veränderungen im Sp3-Expressionsmuster. Eine signifikante Reduktion der Sp3-SUMO-Modifikation zeigte sich nach der Behandlung mit MG-132, einem zell-permeablen Inhibitor des Proteasoms. Möglicherweise ist dieser Proteasom-Inhibitor mit dafür verantwortlich, daß SUMO-spezifische Proteasen nicht abgebaut werden und diese deshalb das SUMOylierte Sp3 entfernen können. PIAS1 (protein inhibitor of activated STAT) war in einem Yeast-Two-Hybrid Screen identifiziert, bei dem die inhibitorischen Domäne von Sp3 als Köder diente. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß PIAS1 die SUMOylierung von Sp3 in vitro verstärkt und deshalb als SUMO-E3 Ligase bei der Sp3-SUMOylierung wirkt. PIAS1-assoziierte Proteine trugen möglicherweise zur Substratspezifität bei der Sp3-SUMOylierung bzw. SUMOylierung anderer Transkriptionsfaktoren bei und/oder regulierten zudem die Aktivität von PIAS1 in vivo. Zur Reinigung und Identifizierung von PIAS1-assoziierten Proteinen wurde eine Anzahl C-terminal getagter Expressionsplasmide mit konstitutiver und induzierbarer Expression konstruiert. Das Dual-Tag Affinitäts-Reinigungs-System, das während dieser Arbeit etabliert wurde, beinhaltet ein kleines 15 Aminosäuren-umfassendes artifizielles Tag (BiotinTAG) welches von der BirA Ligase nach Kotransfektion eines geeigneten Expressionskonstruktes biotinyliert werden kann. Um die Spezifität zu erhöhen, wurde ein zweites Tag in die Expressionsvektoren kloniert (Calmodulin Bindepeptid oder alternativ FLAG oder TripleFLAG). Zusätzlich erfolgte die Konstruktion von Dual-Tag-Expressionsplasmiden für Sp3. Die Etablierung von stabilen Zelllinien, die diese Fusionsproteine induzierbar exprimieren, wurde initiiert. Derartige Zelllinien wären ideal für weitere Analysen der Aktivität von PIAS1 und für die Reinigung von PIAS1 (Sp3) assoziierten Faktoren.