On the enzymatic mechanism of 2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase from Clostridium difficile

Die Gene ldhA und hadA aus Clostridium difficile (DSMZ 1296T) wurden kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden gereinigt und als D-2-Hydroxyisocaproat-Dehydrogenase (LdhA) und 2-Hydroxyisocaproat-CoA-Transferase (HadA) identifiziert. Die Enzyme katalysieren zwei S...

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Main Author: Kim Ji-Hoe
Contributors: Buckel Wolfgang (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2004
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Die Gene ldhA und hadA aus Clostridium difficile (DSMZ 1296T) wurden kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden gereinigt und als D-2-Hydroxyisocaproat-Dehydrogenase (LdhA) und 2-Hydroxyisocaproat-CoA-Transferase (HadA) identifiziert. Die Enzyme katalysieren zwei Schritte in der Fermentation von Leucin zu Ammonium, CO2, Isovalerat und Isocaproat. Die nächsten im Genom von C. difficile liegenden Gene hadBC und hadI wurden ebenfalls aktiv exprimiert und als 2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase (HadBC) und ihrem Aktivator (HadI) identifiziert. Die Dehydratase katalysiert die Eliminierung von Wasser aus (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA zu Isocaprenoyl-CoA, die eine chemisch schwierige Reaktion darstellt, da das Proton in der b-Position nicht aktiviert ist (pK ca. 40). Wir postulieren, dass erst die Reduktion des Substrats mit einem Elektron die Eliminierung ermöglicht, wobei der pK mindestens bis 14 gesenkt wird. Anschließend wird das Elektron wieder ans Enzym zurückgegeben. Die heterodimere Dehydratase und der homodimere Aktivator sind Eisen-Schwefel-Proteine, in denen keine weiteren prosthetischen Gruppen (oder Metalle wie Molybdän) detektiert werden konnten. Der durch Ferredoxin reduzierte Aktivator überträgt unter ATP-Hydrolyse ein Elektron auf die Dehydratase, die dadurch in den katalytisch aktiven Zustand überführt wird. Dieser ATP-getriebene Elektronen-Transfer ähnelt dem der Nitrogenase. Die aktivierte und vom Aktivator abgetrennte Dehydratase katalysiert ca. 10000 Umsätze bis das Elektron durch Oxidation verloren geht. Durch anschließende Zugabe von ATP und Aktivator kann die inaktivierte Dehydratase wieder voll aktiviert werden. Die Bildung eines stabilen aktiven AlF4--induzierten Komplexes aus Dehydratase und Aktivator stützt den postulierten Elektronentransport vom Aktivator zur Dehydratase und zeigt ebenfalls die Rückgewinnung des benötigten Elektrons nach jedem Turnover. In Übereinstimmung damit werden zur maximalen Aktivität nur substöchiometrische Mengen an Aktivator (Aktivator/Dehydratase = 1:10) benötigt. Mit Hilfe der EPR-Spektroskopie wurde zum ersten Mal während der Dehydratisierung eines 2-Hydroxyacyl-CoA-Derivats ein organisches Radikalsignal detektiert. Mit Hilfe von isotopmarkierten Substraten veränderten sich die EPR-Spektren in einer für das Ketylradikalanion des Isocaprenoyl-CoA charakteristischen Weise.
DOI:10.17192/z2004.0646