Kristallstrukturen von F420-abhängiger Alkohol-Dehydrogenase (Adf) und F420-abhängiger Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer)

Coenzym F420 ist ein 5Ž-Deazaflavin-Derivat, das in methanogenen Archaea in hohen Konzentrationen vorkommt und für die gelb-grüne Fluoreszenz dieser Organismen verantwortlich ist. Es ist an Hydrid-Transferase Reaktionen im Energie- und Baustoffwechsel dieser Organismen beteiligt. Bisher wurden acht...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Aufhammer, Stephan, Walter
Beteiligte: Thauer, Rolf , K. (Prof. Dr. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2004
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Beschreibung
Zusammenfassung:Coenzym F420 ist ein 5Ž-Deazaflavin-Derivat, das in methanogenen Archaea in hohen Konzentrationen vorkommt und für die gelb-grüne Fluoreszenz dieser Organismen verantwortlich ist. Es ist an Hydrid-Transferase Reaktionen im Energie- und Baustoffwechsel dieser Organismen beteiligt. Bisher wurden acht F420-abhängige Oxidoreduktasen in methanogenen Archaea gefunden, die alle Si-Seiten-spezifisch bezüglich des Hydrid-Transfers sind. Von den acht Enzymen zeigen zwei Sequenzverwandtschaft zur Enzymfamilie der bakteriellen Luciferase (LuxA). Es handelt sich hierbei um F420-abhängige Alkohol-Dehydrogenase (Adf) und F420-abhängige Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer), die untereinander bis zu 26% sequenzverwandt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals die Kristallstrukturen der Alkohol-Dehydrogenase Adf und der Reduktase Mer mit gebundenem Coenzym F420 ermittelt. Die Struktur der F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase (Adf) aus Methanoculleus thermophilicus wurde mit einem gebundenen F420-Aceton Addukt bei einer Auflösung von 1,8 Å gelöst. Das Enzym liegt als Homodimer vor. Die Monomere besitzen eine (α/β)8-Faltung, bekannt als TIM-Barrel, und weisen eine nicht-Prolin-cis-Peptidbindung auf. Die Tertiärstruktur weicht von der Grundstruktur des TIM-Barrels durch zusätzliche Domänen mit Sekundärstrukturelementen ab, die als Insertions-Regionen bezeichnet werden. Insertions-Regionen bilden die Kontaktstelle für die Dimerisierung und sind an der Substratbindung beteiligt. Coenzym F420 bindet in einer Bindetasche, welche 15 Å tief von der Oberfläche bis in das Zentrum des Enzyms hineinreicht. Schwache Wechselwirkungen von F420 zu Amid-N und Carbonyl-O Atomen der Proteinhauptkette tragen wesentlich zu seiner Bindung bei. Die in Proteinen selten zu beobachtende nicht-Prolin-cis-Peptidbindung dient der Fixierung des Deazaflavin-Rings an seiner Re-Seite. Diese energetisch instabile cis-Bindung wird durch benachbarte, intramolekulare Wechselwirkungen stabilisiert. Der als Isoalloxazin-Ring bezeichnete Deazaflavin-Ring liegt in einer `gebogenenŽ Konformation vor und weicht um 27° von einer planaren Konformation ab. Der Aceton-Teil des gebundenen F420-Aceton Addukts bindet kovalent am C5 auf der Si-Seite des Deazaflavin-Rings. Mit dieser Hilfe war es möglich, 2-Propanol in das aktive Zentrum des Enzyms zu modellieren. Reste, welche an der Bindung von 2-Propanol und am Hydridtransfer beteiligt sind, wurden identifiziert und zudem wurde ein katalytischer Mechanismus postuliert. Die Kristallstruktur von F420-abhängiger Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase (Mer) aus Methanosarcina barkeri wurde mit gebundenem Coenzym F420 bei einer Auflösung von 2,6 Å ermittelt. Das Enzym liegt als Homotetramer vor. Mer-Monomere haben eine (α/β)8-Tertiärstruktur mit zusätzlichen Insertionsregionen. Innerhalb des aktiven Zentrums bindet F420 hauptsächlich über schwache Wechselwirkungen zu Amid-N und Carbonyl-O Atomen der Protein Hauptkette. Ausnahmen sind an der Bindung beteiligte Seitenketten von His36 und Lys161. Die nicht-Prolin-cis-Peptidbindung, an identischer Position zu Adf, fixiert den Deazaflavin-Ring. Der Isoalloxazin-Ring weist in Reduktase Mer die aus Alkohol-Dehydrogenase Adf bekannte gebogene Konformation auf. Ein unbekanntes Molekül bindet kovalent am C5 des Coenzyms. Anhand von Mer-Strukturvergleichen konnte eine F420-bedingte Konformationsänderung in einer flexiblen Domäne einer Insertions-Region beobachtet werden. Zwischen zwei Insertionsregionen des TIM-Barrels bindet Polyethylenglykol, welches als Präzipitant im Kristallisationsansatz vorlag. Die unspezifische Bindung von Polyethylenglykol an einer potentiellen Substratbindestelle in Mer wird im abschließenden Teil dieser Arbeit diskutiert. Aufgrund der Struktur der F420-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase und der F420-abhängigen Methylentetrahydromethanopterin-Reduktase in Abwesenheit und in Gegenwart von F420 wird ein Katalysemechanismus für diese beiden Enzyme vorgeschlagen und F420 in das aktive Zentrum der strukturverwandten bakteriellen Luciferase modelliert. Abschließend wird die in der LuxA-Familie konservierte F420-bzw. FMN-Bindestelle mit der in F420H2:NADP-Oxidoreduktase und 8-HDF-Photolyase verglichen, die weder untereinander noch mit der Luciferase-Familie Sequenzverwandtschaften zeigen. Die Ergebnisse der vorliegenden Doktorarbeit sind in zwei Orginalarbeiten beschrieben, die den Ergebnisteil der Dissertation bilden.
DOI:10.17192/z2004.0625