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Lokalisation und Gen - Expressionsregulation der neutralen Endopeptidase in der humanen Prostata
Die neutrale Endopeptidase (NEP, EC 3.4.24.11; weitere Synonyme: Neprilysin, CD 10, CALLA) ist ein Typ II - integrales Membranenzym in Säugerzellen, die als Zink enthaltende Endopeptidase die lokale Konzentrationen der Peptidsubstrate und der dazugehörigen Peptid-vermittelten Sig...
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| Main Author: | |
|---|---|
| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2004
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Die neutrale Endopeptidase (NEP, EC 3.4.24.11;
weitere Synonyme: Neprilysin, CD 10, CALLA) ist ein Typ II -
integrales Membranenzym in Säugerzellen, die als Zink
enthaltende Endopeptidase die lokale Konzentrationen der
Peptidsubstrate und der dazugehörigen Peptid-vermittelten
Signalübertragungsprozesse steuern kann. Im Gegensatz zu den
anregendaten, die von NEP-Aktivität und -Regulation in den
Prostataepithelzellen handeln, nur einige Studien sind auf dem
zellularen Expression und der Lokalisation der NEP in den
Stromal- und Karzinom-zellen der Prostata vorhanden. Um zu
prüfen, ob Unterschiede in der NEP-Verteilung in der normalen
und der pathologisch veränderten Prostata als auch in der
Prostatazellen bestehen, wurde die NEP-Lokalisation mit Hilfe
der indirekten Immunfluoreszenz - Methode an Prostatazellen und
Paraffinschnitten der humanen Prostata untersucht. In der
normalen adulten Prostata, wurde die NEP hauptsächlich an der
apikalen Plasmamembran detektiert. Im Stroma wurden die
Endothelzellen der Kapillaren und einige glatte Muskelzellen
schwach gefärbt. In hyperplastischen Drüsen war die
Immunreaktivität der NEP in den adluminalen Zellen an der
apikalen Plasmamembran nachzuweisen. Im Stroma wurden auch die
Endothelzellen der Kapillaren und glatte Muskelzellen gefärbt.
Im Prostatakarzinom war meist eine generalisierte
Immunreaktivität der Zellen vorhanden und die NEP war nicht auf
die apikale Plasmamembran beschränkt. Sie verteilte sich
vielmehr im gesamten Zytoplasma und ist damit offensichtlich
ein Indikator für den Polaritäts- bzw. Differenzierungsverlust
in anaplastischen Prostata-karzinomzellen. Die LNCaP zeigten
eine intensive Färbung der Plasmamembran, das gesamte
Zytoplasma wurde schwächer gefärbt, während die hPCPs nach
Inkubation mit dem Antikörper nur eine schwache Reaktion in
Zytoplasma aufwiesen. NEP-Genexpression wurde von RT-PCR
überwacht, und NEP mRNA im menschlichen Prostatagewebe und in
Prostatazellen wurde mittels in-situ-RT-PCR ermittelt.
Prostatagewebe zeigte starke Signale im glandulären Epithel und
schwache Signale im Stroma, kultivierte Zellen zeigten starke
Signale in den Prostatakrebszellen (LNCaP) und schwache Signale
in den stromal Zellen an (hPCPs). Die NEP-Protein wurde mit
Hilfe der Westernblot-Analyse an Lysaten der epithelialen LNCaP
und der stromalen hPCPs nachgewiesen. Die Experimente
bestätigen den Expression von NEP nach beiden Zelle Arten,
jedoch zeigte das Experiment mit hPCPs Zellen zwei Bänder. Um
zu untersuchen, ob Androgene und Neuropeptide in die Expression
der NEP in LNCaP- bzw. hPCPs-Zellen involviert sind, wurde die
Expression der NEP durch Northern-Blot-Analyse der Total-RNA
untersucht. Ohne Stimulation ist eine grundlegende
NEP-Expression in den LNCaP-Zellen detektierbar, Die Behandlung
mit DHT bzw. Bombesin führt zu einer 4-Fach-Erhöhung der
NEP-Expression. In den hPCPs-Zellen ist kaum eine
NEP-Expression detektierbar und die Expression ist unabhängig
von DHT- oder Bombesin-Stimulation. Die basale NEP-Expression
in den hPCPs-Zellen besitzt im Vergleich zu den LNCaP-Zellen
nur eine um ca. 30% Menge. Die Sequenzanalyse des NEP-Promotors
deckt zwei Androgenresponsionselemente einschließlich ein
typisches ARE auf, welches Androgen-, Progesteron- und
Glukocorticoid-Receptoren bindet und ein einzigartiges ARR, das
nur Androgenreceptor bindet. Durch Deletionsanalyse und
Transfektionsexperiment der Promotorkonstrukte wurden mehre
cis-regulatorische Elemente am NEP-Typ II Promotor
identifiziert. Mit Deletionsanalyse und Transfektionsexperiment
der Promotorkonstrukte, DNase I Footprinting und Bandshift
wurden zwei an die proximale Promotorregion bindene Faktoren
identifiziert, ein Sp-Faktor an der GC-Box von -250 bis -262
bindet und ein NF-Y Faktor an der CCAAT-Box im Schutzbereich
-142 / -110 des Promotors bindet. Transfektion des
Reportergenkonstruktes mit durch Mutation standene Variation
der Verbindungsstelle, die in EMSAs die DNA-Bindung blockieren
kann, zeigte, daß NF-Y für die basale Aktivität des Promotors
wichtig ist und daß der Sp-Faktor wichtig für die
Androgen-Responsewirkung des Androgen-Responseelements
ist. |
|---|---|
| DOI: | 10.17192/z2004.0167 |