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Klonierung von Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen aus Ammi majus L. und funktionelle Expression der Zimtsäure 4-Hydroxylase
Pflanzen reagieren auf Pathogenbefall mit einem komplexen System von physiologischen Reaktionen. Auslöser ist die Erkennung von Oberflächenstrukturen der Pathogene, die als Elicitoren wirken. Am Ende der Elicitor-induzierten Signaltransduktionskette steht die Aktivierung von Abwehrge...
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| Main Author: | |
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2004
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Pflanzen reagieren auf Pathogenbefall mit einem
komplexen System von physiologischen Reaktionen. Auslöser ist
die Erkennung von Oberflächenstrukturen der Pathogene, die als
Elicitoren wirken. Am Ende der Elicitor-induzierten
Signaltransduktionskette steht die Aktivierung von Abwehrgenen.
Ein Teilaspekt ist dabei die Akkumulation von Phytoalexinen, im
Falle der Apaiceae sind es Furanocunmarine. Aus Einbaustudien
und in vitro-Messungen ist bekannt, dass an der Biosynthese der
Furanocumarine mehrere Cyt P450 beteiligt sind, die durch Hefe
oder pilzlichen Elicitor induziert werden können.
Aus cDNA
von Elicitor-induzierten Ammi majus-Zellkulturen wurden fünf
Cyt P450 kloniert, deren Northern-Analyse ergab, dass drei
davon auf transkriptioneller Ebene induzierbar sind, wobei
AmCYP71AJ1 am deutlichsten induziert wird.
Sequenz 1,
CYP73A41, wurde funktionell als Zimtsäure 4-Hydroxylase
identifiziert und biochemisch charakterisiert. Ihre
Eigenschaften entsprechen im Wesentlichen den bereits
klonierten C4Hs. Es bleibt die Identifizierung der anderen Cyt
P450 durch Verbesserung und Kontrolle der Expression und Suche
nach möglichen Substraten. Auf dem Wege zu einer Verbesserung
der Expression wurde die NADPH-Cytochrom P450 Reduktase (CPR)
kloniert mit dem Ziel eine simultane Expression der CPR und des
zu untersuchenden Cyt P450 in Hefe durchzuführen.
Im
Sequenzvergleich weist Sequenz 2 (AmCYP71AJ1) auf der Ebene der
Aminosäuren 66 % Ähnlichkeit zur Menthofuransynthase (MFS) aus
Mentha x piperita (Q947B7, Bertea et al, 2001) auf. Da kein
Menthofuran in Ammi majus beschrieben worden, ist es
unwahrscheinlich, dass AmCYP71AJ1 die Bildung von Menthofuran
katalysiert. Die Induktionsstärke und der Induktionsverlauf der
relativen Transkriptmenge von AmCYP71AJ1 passen zu der
Induktion der Marmesinsynthase-Aktivität, einem Cyt P450 der
Psoralenbiosynthese. Vermutlich handelt es sich bei AmCYP71AJ1
um ein Enzym der unspezifischen Abwehr, eventuell sogar aus der
Furanocumarinbiosynthese.
Die Sequenz 3 (AmCYP98A21) ist auf
Aminosäureebene zu 83 % identisch mit der Ocimum basilicum
p-Cumaroyl Shikimat 3'-Hydroxylase und ist auf
Transkriptiosnebene induzierbar.
Die Sequenz 4 (AmCYP76B8)
hatte 55 % identische Aminosäuren mit der Geraniol
10-Hydroxylase aus Catharanthus roseus. Der Northern-Blot
zeigte im Gegensatz zur G10H aus Catharanthus roseus keine
Induktion. Eine Zuordnung der nicht induzierten Sequenz 5
(AmCYP82H1) kann nicht erfolgen.
Neben der wissenschaftlichen
Grundlage haben die Untersuchungen auch praktische Bedeutung.
Kenntnisse über die Biosynthese der Furanocumarine sind für den
Menschen von Interesse. Es hat sich gezeigt, dass der Gehalt an
Furanocumarinen in Sellerie aufgrund von saurem Nebel in
kalifornischen Ballungsgebieten stark zunimmt, so dass die
Konzentration über der Menge liegt, die beim Menschen nach
Verzehr eine Dermatitis auslösen kann. Zudem wird eine solche
Pflanze ungeniessbar für Insekten. Indem man regulierend in die
Biosynthese eingreift, könnte man Sellerie herstellen, der
keine Psoralene enthält, und somit auch in Gebieten mit grosser
Luftverschmutzung angebaut werden kann. |
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| DOI: | 10.17192/z2004.0072 |