A LysR-family transcriptional regulator is involved in the selenium-dependent transcriptional regpression of selenium-free hydrogenase gene groups in Methanococcus voltae
Methanococcus voltae besitzt zwei Coenzym F420 reduzierende und zwei Coenzym 420 nicht reduzierende Hydrogenasen. Zwei davon, Fru und Vhu, sind Selenoproteine. Eine F420 reduzierende Hydrogenase (Frc) und eine F420 nicht reduzierende Hydrogenase (Vhc) enthalten kein Selenocystein....
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | English |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2003
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Methanococcus voltae besitzt zwei Coenzym F420
reduzierende und zwei Coenzym 420 nicht reduzierende
Hydrogenasen. Zwei davon, Fru und Vhu, sind Selenoproteine.
Eine F420 reduzierende Hydrogenase (Frc) und eine F420 nicht
reduzierende Hydrogenase (Vhc) enthalten kein Selenocystein.
Die Gengruppen, die für diese Enzyme codieren, sind durch eine
gemeinsame intergene Region verbunden. Es wurde beschrieben,
dass die Transkription der vhc-frc-Cluster durch die
Anwesenheit von Selen im Wachstumsmedium inhibiert wird, obwohl
die Anwesenheit von Spuren von Selen die Voraussetzung dafür
ist, dass unter Laborbedingungen maximale Wachstumsraten
erreicht werden. Ortsspezifische Mutagenese in der intergenen
Region führte zur Identifizierung von Bindungsstellen für
positiv und negativ regulatorischen Proteine geführt.
In den
hier beschriebenen Untersuchungen wurde das Gen für
ß-Glucuronidase (uidA) benutzt, um das Transkriptionsniveau der
frc- und vhc-Gengruppen in M. voltae-Stämmen (F3 und V1) in
vivo indirekt zu verfolgen. Insertionsvektoren wurden
konstruiert, um Zufalls-insertionen zu erzeugen. Mit diesem
Ansatz wurden keine deregulierten Mutanten gefunden.
Jedoch
führte die Transformation mit einem Integrationsvektor, der die
frc-vhc-intergene Region als Promotorregion für den
Selektionsmarker trug, zur Derepression eines
Hydrogenasepromotors unter gleichzeitiger Amplifikation des
Vektors im Chromosom. Dies wurde als weiterer Anhaltspunkt
dafür angesehen, dass es eine Bindungsstelle für den negativen
Regulator in der intergenen Region gibt.
Daraufhin wurde
DNA-Affinitiätschromatogrphie eingesetzt, um zu versuchen,
(das) negative Regulatorprotein(e) zu reinigen. An
biotinmarkierter DNA, die die hypothetische Bindungsstelle für
den negativen Regulator in der intergenen Region enthielt,
wurde ein Protein teilweise gereinigt. Die N-terminale Sequenz
des Proteins wurde bestimmt. BLAST-Analysen ergaben, dass es
zur LysR-Familie prokaryotischer Regulationsproteine gehört.
Nach der Erstellung der kompletten Nukelotidsequenz, wurde ein
Knockout des Gens im M. voltae-Stamm V1 durchgeführt. Die
Zerstörung des Gens im Stamm V1 führte zur Transkription des
Reportergens und auch der Hydrogenasegene in Gegenwart von
Selen. Dieser Regulator erhielt daher den Namen HrsM
(selenabhängiger Repressor von Hydrogenasen in Methanococcus
voltae). HrsM ist der erste beschriebene zur bakteriellen
LysR-Familie gehörige Regulator in Archaea. |
|---|---|
| Physical Description: | 95 Pages |
| DOI: | 10.17192/z2003.0658 |