Reinigung des Transkriptionsfaktors IIIC1 der RNA-Polymerase III und Identifizierung potentieller TFIIIC1 Untereinheiten

Die humane RNA-Polymerase III synthetisiert kleine, nicht proteinkodierende RNAs, die unterschiedlichen Gengruppen angehören und für deren Herstellung verschiedene Transkriptionsfaktoren benötigt werden. Ein zentraler Transkriptionsfaktor im Polymerase-III-System ist TFIIIC1, der für die Expression...

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Main Author: Hafner, Heike Manuela
Contributors: Prof. Dr. Dr. K. H. Seifart (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2003
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Die humane RNA-Polymerase III synthetisiert kleine, nicht proteinkodierende RNAs, die unterschiedlichen Gengruppen angehören und für deren Herstellung verschiedene Transkriptionsfaktoren benötigt werden. Ein zentraler Transkriptionsfaktor im Polymerase-III-System ist TFIIIC1, der für die Expression aller Polymerase-III-abhängigen Gene essentiell benötigt wird. Seine Struktur und Wirkungsweise konnte jedoch bisher nicht aufgeklärt werden. In dieser Arbeit wurde zunächst die Beziehung von TFIIIC1 zu anderen, die Polymerase III-Transkription stimulierenden Proteinen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TFIIIC1 in keinerlei Zusammenhang mit der Proteinkinase CK2 oder der DNA-Topoisomerase I steht, die beide in anderen experimentellen Systemen einen positiven Einfluss auf die Effizienz der Polymerase III-Transkription aufgewiesen hatten. Voraussetzung für ein besseres Verständnis der Wirkungsweise von TFIIIC1 ist seine weitere Reinigung bis hin zur Sequenzierung und Klonierung seiner Untereinheiten. Hierfür wurde zunächst nach dem Standard-Protokoll eine Phosphocellulose-Chromatographie durchgeführt, der eine MonoQ-Chromatographie folgte. Als neuer Kationenaustauscher wurde anschließend das MonoS-Säulenmaterial eingesetzt, das zum einen eine sehr gute Reinigungseffizienz zeigte und über das zum anderen zwei verschiedene Formen von TFIIIC1 voneinander getrennt werden konnten. Das unterschiedliche chromatographische Verhalten dieser Formen ist vermutlich auf einen unterschiedlichen Modifikationsgrad zurückzuführen. Da auch bei der MonoS-Chromatographie mit TFIIIC1-like zwei Aktivitätspeaks gefunden wurden, ist es möglich, dass es sich bei TFIIIC1-like um eine Subpopulation von TFIIIC1 handelt. Diese besteht wiederum selbst aus zwei unterschiedlichen Formen, so dass man von mindestens vier verschiedenen Formen von TFIIIC1 sprechen kann. Ein ergänzender Weg zur Darstellung der Untereinheiten von TFIIIC1 bestand in der Assemblierung und Isolierung von vollständigen und partiellen VA I-Transkriptionskomplexen. Hierfür wurden neben Kontroll-Gelfiltrationsläufen TFIIIC2-TFIIIBb-VAI- sowie TFIIIC2-TFIIIBb-TFIIIC1-VAI-Teilkomplexe assembliert, die anschließend über eine S500-Gelfiltration von den freien, nicht in den Komplex integrierten Proteinen abgetrennt wurden. Die isolierten Teilkomplexe konnten durch Zugabe fehlender Faktoren und der Polymerase III vervollständigt werden und zeigten in Anwesenheit von Nukleotiden eine sehr gute Transkriptionsaktivität. Nach Abgleich mit den entsprechenden Kontroll-Gelfiltrationsläufen konnten schließlich sechs potentiell zu TFIIIC1 gehörende Untereinheiten in einem silbergefärbten SDS-Gel identifiziert werden; die gefundenen Polypeptide besaßen eine Größe von etwa 43, 57, 65, 69, 140 und 164 kDa. Diese Größen konnten auch durch klassische Chromatographie-Experimente bestätigt werden.
DOI:10.17192/z2003.0454