Photolyase/Cryptochrom-Homologe aus Synechocystis sp. PCC 6803 und Arabidopsis thaliana: Funktion, Lokalisation und biochemische Eigenschaften
In dieser Arbeit wurden Photolyase/Cryptochrom-homologe Proteine (cry und phr) aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 und ein neues Cryptochrom (At-cry3) aus der Hoeheren Pflanze Arabidopsis thaliana charakterisiert. Synechocystis CRY liegt mit den offenen Leserastern sll1628 und sll16...
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|---|---|
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2003
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | In dieser Arbeit wurden Photolyase/Cryptochrom-homologe Proteine
(cry und phr) aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 und ein
neues Cryptochrom (At-cry3) aus der Hoeheren Pflanze Arabidopsis thaliana
charakterisiert.
Synechocystis CRY liegt mit den offenen Leserastern sll1628 und sll1630 in
einem Operon. Die durch sll1628 kodierte Aminosaeuresequenz besitzt eine
schwache Homologie zu einem TPR (tetratricopeptide repeat)-Domaenen Protein;
die sll1630 Aminosaeuresequenz ist zu keinem bekannten Protein homolog.
Für das in E. coli heterolog exprimierte Synechocystis cry konnte nachgewiesen
werden, dass es nicht kovalent FAD bindet. Die phr und cry Mutanten zeigten
hinsichtlich Wachstum und Pigmentzusammensetzung weder unter photoautotrophen und heterotrophen Wachstumsbedingungen noch im Dauer-Blau- oder Rotlicht einen
vom Wildtyp abweichenden Phaenotyp.
Im UV-B ist in der cry Mutante im Gegensatz zur phr Mutante und dem Wildtyp
die de novo Synthese fuer das D1 Protein des Photosystem II nicht induziert.
In der cry Mutante ist ferner die Phototaxis zum Rot- und Dunkelrotlicht
reduziert. Mittels quantitativer RT-PCR-Analysen wurde die lichtabhaengige
Induktion der Transkription des psbA3 Gens, das fuer das Photosystem II D1
Protein kodiert, ueber einen großen Spektralbereich und beim Wechsel von
niedriger zu hoher Fluenzrate untersucht. Unter den gewaehlten Lichtbedingungen
ist mit Ausnahme von Dunkelrot in der cry Mutante die psbA3 Induktion
abgeschwaecht, besonders drastisch im UV-A-Bereich. Somit wurde in dieser
Arbeit gezeigt, dass sll1629 fuer ein Cryptochrom kodiert.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Protein At5g24850 (At-cry3) aus
Arabidopsis thaliana untersucht. At-cry3 ist 569 Aminosaeuren gross und
besitzt ueber einen Bereich von 400 Aminosaeuren ca. 50 Prozent Identitaet zu
Synechocystis cry. Durch in vitro Import und GFP-Lokalisationsstudien wurde
nachgewiesen, dass die N-terminalen 63 Aminosaeuren von At-cry3 notwendig und
hinreichend fuer den Import dieses Proteins sowohl in Mitochondrien als auch
in Chloroplasten sind. At-cry3 wurde als His-tag-Fusion heterolog in E. coli
ueberexprimiert. Spektroskopische Analysen zeigten, dass At-cry3 nicht
kovalent FAD bindet. Weder spektroskopisch noch mit Duennschichtchromatographie
konnte ein zweiter Kofaktor nachgewiesen werden. Durch Expression von At-cry3
in einem Photolyase-defizienten E.-coli-Stamm und in vitro und in vivo
Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass At-cry3 keine Photolyaseaktivitaet
besitzt. Ferner zeigten in vitro DNA-Bindungsstudien, dass At-cry3
sequenzunspezifisch an einzel- und doppelstraengige DNA bindet. Die Frage, ob
At-cry3 eine Mutation in Synechocystis cry komplementieren kann, kann mit den
vorliegenden Daten noch nicht abschliessend beantwortet werden.
In Zusammenarbeit mit unserer AG hat Peter Lockhart, Massey University,
New Zealand, einen Stammbaum mit ueber 70 Mitgliedern der
Photolyase/Cryptochrom-Familie erstellt. Dieser deutet an, dass Pflanzen ihre
Cryptochrome durch einen dualen horizontalen Gentransfer erhalten haben
koennten: das CRY3 Gen von Cyanobakterien, den Vorlaeufern der Plastiden,
Gene der CRY1/CRY2-Familie von Aplpha-Proteobakterien, den Vorlaeufern heutiger Mitochondrien. |
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| Physical Description: | 185 Pages |
| DOI: | 10.17192/z2003.0135 |