Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel:Elektrophysiologische Charakterisierung der Locus coeruleus Neuronen von Parkin­-Knockout Mäusen mit Hilfe der Patch­-Clamp­-Technik
Autor:Müller, Ann-Katrin
Weitere Beteiligte: Decher, Niels (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2021
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2022/0174
DOI: https://doi.org/10.17192/z2022.0174
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2022-01742
DDC: Medizin
Publikationsdatum:2022-04-28
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Parkinson Erkrankung, Patch-Clamp, Locus coeruleus, Parkin, Ubiquitin

Zusammenfassung:
Die Parkinson-Erkrankung (engl. Parkinson‘s Disease) gilt als zweit häufigste neurodegenerative Erkrankung weltweit nach der Alzheimer-Erkrankung. Die Hälfte aller autosomal-rezessiv vererbten Fälle familiärer Parkinson-Erkrankungen (PK) kann auf Funktionsverlustmutationen des Parkin-Gens, sogenannte PARK2-Mutationen, zurückgeführt werden. Typischerweise manifestiert sich jene hereditäre PK-Form bereits vor dem 40. Lebensjahr und wird somit als Early-Onset PK bezeichnet. Das Enzym Parkin, welches durch PARK2 kodiert wird, besitzt die Funktion einer E3-Ubiquitin-Protein-Ligase, welche in zentralen Neuronen eine Bandbreite von Proteinen durch Ubiquitin-Konjugation markiert. Durch unterschiedliche Arten der Ubiquitin-Konjugation werden unter anderem fehlgefaltete und beschädigte Proteine dem Abbau im Proteasom zugeführt. Zudem erfolgt die Regulation einer Bandbreite zellulärer Signal- und Stoffwechselwege durch Ubiquitylierung, wodurch Parkin auf vielfältige Art und Weise einen neuroprotektiven Effekt vermittelt. Der funktionelle Parkin-Verlust triggert mitochondriale Dysfunktion und Neuroinflammation in vulnerablen Neuronen. Eine eindeutige Erklärung auf molekularer Ebene, weshalb selektive Neuronenpopulationen intrinsisch gesteigerte Vulnerabilität gegenüber Degeneration im Rahmen der PK besitzen, konnte bisher nicht gefunden werden. Diverse für hohe mitochondriale oxidative Stresslevel prädisponierende Faktoren wurden bereits in einer Reihe von Arbeiten diskutiert. Hierzu zählt eine multifaktoriell ausgelöste gestörte Calciumhomöostase, welche im Kontext pathologischer Bedingungen oxidativen Stress provoziert. In der Literatur wird der E3-Ubiquitin-Ligase Parkin eine Schlüsselrolle im Rahmen der zellulären Calciumhomöostase adressiert. Diese Hypothese konnte anhand von Ubiquitylom-Analysen muriner Parkin-Knockout Gehirne unterstützt werden, im Zuge dessen vorrangig Proteine der Calciumhomöostase: Hippocalcin, ATP1A2 und GNA11, eine Dysregulation zeigten. Genannte Parkin-Substrate modulieren calciumabhängig die Generierung und die Form von Aktionspotentialen zentraler Neurone. Aus diesen Erkenntnissen ergibt sich die Frage nach funktionellen Konsequenzen des Parkin-Verlustes auf molekularer Ebene. Aufgrund der begünstigten Vulnerabilität von Locus coeruleus (LC) -Neuronen für parkinson-spezifische pathologische Veränderungen, ist davon auszugehen, dass phänotypische Veränderungen frühzeitig in jener pontin gelegenen Neuronenpopulation zu registrieren sind. Folglich wurden im Rahmen der zugrunde liegenden Arbeit murine LC-Neurone mit Knockout (KO) des Parkin-Gens anhand von Patch-Clamp Messungen in akuten Hirnstammschnitten analysiert. Es erfolgte der Vergleich 6 Monate alter juveniler und 12 Monate alter adulter LC-Neurone in Hirnstammschnitten von Wildtyp (WT)- Mäusen mit LC-Neuronen von Parkin-KO Mäusen. Ziel war es die komplexe Rolle des Parkins im Kontext der PK-Pathogenese zu entschlüsseln. In der Tat spiegelte sich die gestörte Calciumhomöostase in progressiven Veränderungen der intrinsischen Schrittmacheraktivität muriner Parkin-KO LC-Neurone wider. Während die intrinsische Aktivität der LC-Neurone juveniler Mäuse keine Veränderung zeigte, unterschieden sich die LC-Neurone adulter Parkin-KO Mäuse durch eine signifikant beschleunigte Feuerfrequenz. Whole-Cell Current-Clamp Ableitungen ließen zudem eine signifikant verkürzte Aktionspotentialdauer in LC-Neuronen juveniler und adulter Parkin-KO Mäuse erkennen. In adulten Parkin-KO LC-Neuronen zeigte sich außerdem eine signifikant verminderte Amplitude der Nachhyperpolarisation (NHP). Juvenile Parkin-KO LC-Neurone hingegen unterschieden sich durch ein positiveres Schwellenpotential von juvenilen WT LC-Neuronen, während in adulten Mäusen keine Unterschiede des Schwellenpotentials zu erkennen waren. Unauffällige Ergebnisse im Rahmen der Whole-Cell Voltage-Clamp Messungen von Kalium- und Calciumströmen lassen darauf schließen, dass die veränderte Schrittmacheraktivität in Parkin-KO LC-Neuronen nicht aus einer gestörten Expression oder Dysfunktion spezifischer Kalium- oder Calciumkanäle hervorgeht. Unter Berücksichtigung der Interaktion zwischen in Parkin-KO Gewebe akkumuliertem Hippocalcin und spannungsabhängigen KCNQ-Kanälen, erfolgte zudem die pharmakologische Isolation KCNQ-getragener Kaliumströme, durch Applikation des selektiven Blockers HMR1556. Auch KCNQ-getragene Kaliumströme verhielten sich in Parkin-KO LC-Neuronen unverändert. Die Ergebnisse der Stromanalysen deuten darauf hin, dass das beschleunigte Feuerverhalten muriner Parkin-KO LC-Neurone am ehesten auf eine veränderte Calcium-abhängige Erregbarkeit der Plasmamembran zurückzuführen ist, hervorgerufen durch verminderten Umsatz von Parkin-Substraten wie ATP1A2 und Hippocalcin. Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen zum besseren Verständnis der gesteigerten Vulnerabilität monoaminerger Neurone durch eine veränderte Calciumhomöostase und des selektiven Neuronenuntergangs im Kontext der PK beitragen.

Summary:
Parkinson’s Disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder worldwide following Alzheimer’s Disease. Loss-of-function mutations in the PARK2 gene, which encodes the enzyme Parkin, have been implicated in nearly 50 % of inherited autosomal recessive forms of PD. Typically, this hereditary PD variant manifests itself before the age of 40 and is therefore referred to as early-onset PD. Parkin is an E3 ubiquitin ligase that plays a curcial role in labelling a range of proteins in central neurons via ubiquitin conjugation. Different types of ubiquitin conjugation cause misfolded or damaged proteins to be directed towards degradation in proteasomes or lysosomes. Moreover, Parkin-dependent ubiquitylation contributes to cellular signaling pathways, which are involved in neuroprotective cellular processes. Functional loss of Parkin triggers mitochondrial dysfunction and inflammation, which leads to neurodegeneration in vulnerable neurons. A clear explanation at the molecular level for selective vulnerability of certain neuronal populations for PD-dependent cell loss has not yet been found. A variety of factors that predispose to high mitochondrial oxidative stress levels have already been discussed. Previous studies show a multifactorial triggered disturbed calcium homeostasis, which increases susceptibility for oxidative stress in the context of pathologic conditions. In the literature Parkin is described to play a key in the context of cellular calcium homeostasis. This hypothesis was supported by ubiquitylome profiling of murine Parkin knockout (KO) brains. These studies have revealed dysregulation of the calcium homeostasis factors ATP1A2, Hippocalcin and GNA11. The listed neuron-specific Parkin substrates are known to modulate the generation and the shape of action potentials of central neurons. Therefore, the question of functional consequences arises, such as whether neuronal excitability is altered in vulnerable neurons, due to loss of Parkin function. Due to the specific vulnerability of Locus coeruleus (LC) neurons for PD specific pathological changes it can be assumed that phenotypical alterations most likely occur early in that nucleus. Therefore, in the current study patch clamp experiments of LC neurons in acute brain slices of Parkin-KO or wildtype mice were performed time-dependently. My objective was to reveal the role of Parkin in the context of PD pathophysiology especially in electrophysiological alterations. Patch clamp experiments in acute Parkin-KO brain slices of 12 month old mice indeed revealed progressive alterations in the intrinsic pacemaker activity of noradrenergic LC neurons, which can be correlated to an impaired calcium homeostasis. LC neurons of aged Parkin-KO brain showed an acceleration of the spontaneous pacemaker frequency, a reduction in slow afterhyperpolarization and a shortening of action potential duration. Inconspicuous results from the Whole-Cell Voltage-Clamp measurements of potassium and calcium currents suggest that the changed pacemaker activity in Parkin-KO LC neurons does not result from a disturbed expression or dysfunction of specific potassium or calcium channels. Taking into account the interaction between hippocalcin accumulated in Parkin-KO tissue and voltage-dependent KCNQ channels, the pharmacological isolation of KCNQ mediated potassium currents was carried out by applying the selective blocker HMR1556. KCNQ-borne potassium currents also remained unchanged in Parkin-KO LC neurons. The results of the current study indicate that the altered pacemaker activity of murine Parkin-KO LC neurons is most likely due to an altered calcium-dependent excitability of the plasma membrane, caused by diminished turnover of potential Parkin substrates such as ATP1A2 and Hippocalcin. The results of this work should contribute to a better understanding of the increased vulnerability of monaminergic neurons due to an altered calcium homeostasis and the selective neuronal loss in context of PD.


* Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten