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Titel:Die Rolle von CUX1 bei Hypoxie im hepatozellulären Karzinom
Autor:Blümel, Sophie Anna
Weitere Beteiligte: Wissniowski, Thaddäus Till (PD Dr.)
Veröffentlicht:2021
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2022/0135
DOI: https://doi.org/10.17192/z2022.0135
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2022-01350
DDC: Medizin
Publikationsdatum:2022-02-17
Lizenz:https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Gastroenterologie, gastroenterology, hypoxia, liver cancer, Leberkrebs, oncology, CUX1, Onkogen, hepatocellular carcinoma, Onkologie, Hypoxie, hepatozelluläres Karzinom, oncogene, CUX1

Zusammenfassung:
Das hepatozelluläre Karzinom ist durch ein hypoxisches Milieu gekennzeichnet. Die Adaptationsvorgänge der Tumorzellen an Hypoxie, vermittelt über den zentralen Mediator HIF-1α, sind gekennzeichnet durch gesteigerte Angiogenese, Anpassung des Stoffwechsels und Zellproliferation. Der Transkriptionsfaktor CUX1 (CUTL1), Teil der Homöodomain Genfamilie, ist vielfältig in Vorgänge der Zellproliferation und –differenzierung eingebunden. In Tumorzellen wurde CUX1 mit vermehrter Invasion, Migration und Apoptoseresistenz in Verbindung gebracht, wobei seine genaue Rolle in der Tumorentstehung umstritten ist. Im hepatozellulären Karzinom ist CUX1 mit Erhöhung des Tumormarkers AFP assoziiert. Ziel der Arbeit ist die Darstellung des Zusammenhangs zwischen CUX1 und den Anpassungsvorgängen von hepatozellulären Karzinomzellen an Hypoxie. Hierzu wurde versucht, die Expression von CUX1 mittels siRNA in HepG2 und Hep3B Zellenherunterzuregulieren. Ein Knock-down Effekt konnte auf RNA-Ebene mehrfach beobachtet, jedoch nicht endgültig mit statistischer Signifikanz und eindeutig im Western Blot bestätigt werden. Hypoxie wurde in den Zellen mittels Behandlung mit 150 µM CoCl2 oder Inkubation mit 0,5% Sauerstoff induziert. CUX1, Hypoxiemarker und Zellstressfaktoren wurden mittels q-RT-PCR, Western Blot und einem Antikörper Array bestimmt. Zur Bestimmung des Einflusses von CUX1 auf die transkiptionelle Aktivität von HIF-1α erfolgte eine Analyse mittels Luciferase Reporter Vektor im Luciferase Assay. Hier korrelierte die gemessene Lichtintensität der HIF-1α-Bindungssequenz HRE als Reporter mit der HIF1α Aktivität, welche in Zellen mit und ohne CUX1 Herunterregulierung verglichen wurde.Während kein direkter Einfluss von CUX1 auf die Expression von HIF-1α unter Hypoxie gezeigt werden konnte, konnten in der q-RT-PCR Analyse dessen Zielgene GLUT1 und VEGFA nach Herunterregulierung von CUX1 in ihrer Expression vermindert beobachtet werden. Der HIF-1α Gegenspieler FIH-1 zeigte sich nach Herunterregulierung von CUX1 in HepG2 erhöht. Im Luciferase Assay zeigte CUX1 dann einen signifikanten Effekt auf die Transkription von HIF-1α. NachTransfektion mit Cux1-siRNA wurde zudem eine erhöhte Expression der Inhibitoren Cyklin-abhängiger Kinasen p21 (CDKNA1) und p27 (CDKNA2) beobachtet. Insgesamt scheint eine Verminderung von CUX1 zu einer Reduzierung der Zellstressreaktion der Zelllinien zu führen sowie zur Erhöhung der Vulnerabilität gegenüber hypoxischem Stress, besonders in der p53 negativen Hep3B Zelllinie. Es lässt sich vermuten, dass CUX1 im hepatozellulären Karzinom für den Erhalt der Hypoxieantwort eine wichtige Rolle spielt. Dies geschieht möglicherweise über Aufrechterhalten der Transkriptionsfunktion von HIF-1α, am ehesten durch Regulierung dessen Inhibitors FIH-1. Gleichzeitig scheint CUX1 in Hypoxie einem Zellzyklusarrest entgegenzuwirken und könnte so die Zellproliferation trotz des umgebenden toxischen Millieus fördern. Die Beobachtungen unterstützen die in der Literatur beschriebene onkogene Funktion von CUX1, bedürfen jedoch einer weiteren experimentellen Reproduktion und statistischer Bestätigung der beobachteten Effekte.

Summary:
Hepatocellular carcinoma is characterised by a hypoxic environment. Adaption of tumor cells to hypoxia is mediated by the central transcription factor HIF-1α that leads to angiogenesis as well as adaptation of metabolism and cellular proliferation.The transcription factor CUX1 (CUTL1) is part of the homeodomain gene family. It is responsible for mechanisms of cellular proliferation and differentiation. In tumor cells, it has been linked to increased invasion, migration and resistance to apoptosis. Its exact role in tumorgenesis is not completely clarified yet.The aim of this study is the demonstration of a link between CUX1 and the adaptation mechanisms to hypoxia in hepatocellular carcinoma cell lines. It was attempted to transiently knock down CUX1 by siRNA in HepG2 and Hep3B cells. A Knock down of CUX1 transcript was repeatedly observerved by RNA analysis although not statistically confirmed and not supported by a clear Westen Blot. Hypoxia was induced by treatment with 150 µM CoCl2 or incubation with 0.5% oxygen atmosphere. CUX1 as well as markers of hypoxia and cellular stress were detected by q-RT-PCR, western blot and antibody array. The influence of CUX1 on the transcriptional activity of HIF-1α was analyzed by luciferase assay using co-transfected luciferase plasmid and CUX1-siRNA. Here, the measured light intensity of the HIF-α binding sequence HRE correlated with the activity of HIF1-α, which was compared in cells with and without CUX1 knock-down. Whilst no influence of CUX1 on HIF-1α expression was detected, a decreased expression of HIF-1α target genes GLUT1 and VEGFA after knock-down of CUX1 in RT-qPCR was observed. The antagonist to HIF-1α, FIH-1, showed up-regulation after knock-down of CUX1 in HepG2 cells. CUX1 suppression impaired the transcriptional activity of HIF-1α on its ectopic promoter sequence transfected in HCC cells. Moreover, after knock-down of CUX1, a heightened expression of cyclin-dependent kinase inhibitors p21 (CDKNA1) and p27 (CDKNA2) was observed. Generally, CUX1 knock�down seamed to decrease the cell stress reaction in both cell lines and thus seamed to lead to increased sensitivity to hypoxic cytotoxicity, especially in the p53-null Hep3B cell line. It can be speculated that CUX1 plays an important role during hypoxia response in hepatocellular carcinoma. This is probably achieved by sustaining the transcriptional activity of HIF-1α, most likely by regulation of its inhibitor FIH-1. At the same time, CUX1 seemed to counteract cell cycle inhibition and could then promote cell proliferation despite the toxicity caused by hypoxia. These results support the function of CUX1 as an oncogene, as discussed in literature. However further experimental reproduction and a statistical confirmation of the observed effects is needed.


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