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Titel:Bakterielle Ribonuklease P-Enzyme - Evaluierung als Drug Target und Analysen zur Substraterkennung
Autor:Schencking, Isabell
Weitere Beteiligte: Hartmann, Roland (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2021
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2022/0068
DOI: https://doi.org/10.17192/z2022.0068
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2022-00684
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Publikationsdatum:2022-02-03
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
RNase P Endoribonuklease P Aggregatoren Pharmazeutische Chemie Targetvalidierung, Protein aggregators PAINS tRNA processing

Zusammenfassung:
Die Ribonuklease P (RNase P) ist ein essentielles und ubiquitär vorkommendes Enzym, das für die Maturierung von Vorläufer-tRNAs (prä-tRNAs) am 5'-Ende verantwortlich ist. Die architektonische Vielfalt der RNase P ist dabei einzigartig. In Bakterien, Archaeen und den Zellkernen sowie Organellen vieler Eukaryonten setzt sich die RNase P aus einer katalytischen RNA-Untereinheit und einer variierenden Anzahl von Proteinen zu einem Komplex zusammen (ein Protein in Bakterien, mindestens vier in Archaeen und bis zu zehn in Eukaryonten). Darüber hinaus wurde eine Variante der Protein-basierten RNase P (PRORP), der eine RNA-Untereinheit fehlt, in menschlichen Mitochondrien und anschließend in Landpflanzen und einigen Protisten identifiziert. Da sich das pro- und eukaryontische RNase P-Holoenzym strukturell deutlich voneinander unterscheiden, stellt die bakterielle RNase P einen vielversprechenden Angriffspunkt für die Entwicklung neuartiger Antibiotika dar. Im Kontext dieser Arbeit sollte evaluiert werden, inwiefern sich die bakterielle Proteinuntereinheit mit etwaigen Kleinmolekülen adressieren lässt. Als Ausgangspunkt dienten zwei publizierte RNase P-Inhibitoren mit Thiosemicarbazid-Kern bzw. Isoflavon-Grundkörper. In initialen Testungen des Thiosemicarbazids RNPA2000 traten Löslichkeitsprobleme auf, was ein erster Hinweis darauf war, dass die Verbindung eine Protein-Aggregation auslösen könnte. Die durch Kleinmoleküle hervorgerufene Protein-Aggregation ist eine Hauptquelle für falsch-positive Ergebnisse im Rahmen von Studien zur Identifizierung neuer, potentieller Arzneimittelwirkstoffe. Um dieser Problematik nachzugehen, wurden folgende Kontrollexperimente durchgeführt: (i) Zugabe eines Detergens zu den kinetischen Reaktionen des Enzyms, (ii) Variation der Konzentration von RNase P-Holoenzym / Proteinuntereinheit, (iii) Bestimmung der Löslichkeit des potentiellen Inhibitors unter Assay-Bedingungen, (iv) Analyse der Co-Sedimentation der Proteinuntereinheit und des Kleinmoleküls sowie (v) Testung auf Wachstumshemmung eines Bacillus subtilis-Stamms, bei dem das eukaryontische, Protein-basierte Enzym für die prä-tRNA-Prozessierung zuständig ist. Mithilfe der genannten Experimente konnte für RNPA2000 gezeigt werden, dass es sich nicht um einen spezifischen RNase P-Inhibitor handelt, sondern die beobachteten inhibitorischen Effekte vielmehr auf unspezifische Protein-Aggregation zurückzuführen sind. Des Weiteren konnte für das Isoflavon Iriginolhexaacetat und Purpurin, einem weiteren publizierten RNase P-Inhibitor, gezeigt werden, dass es sich bei diesen Verbindungen ebenfalls um Protein-Aggregatoren handelt. Folglich konnte in dieser Arbeit aufgedeckt werden, dass bis dato kein spezifischer Kleinmolekül-Inhibitor literaturbekannt ist, der an die Proteinuntereinheit bindet. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen wurden daraufhin komplett neuartige Strukturen untersucht, die die 5'-Flanken-Bindetasche der Proteinuntereinheit adressieren sollten. Hierzu wurde ein Struktur-basierter und Docking-gestützter Ansatz verfolgt. Zunächst zeigte dabei eine Verbindung mit einer Sulfonat-Gruppe eine schwache RNase P-Inhibition. Im Rahmen von Studien zu Struktur-Wirkungsbeziehungen und der damit einhergehenden Derivatisierung wurden jedoch auch hier Löslichkeitsprobleme und Protein-Aggregation beobachtet, sodass diese Stoffklasse letztlich nicht weiterverfolgt wurde. Zusammenfassend scheint die Proteinuntereinheit der bakteriellen RNase P sehr anfällig gegenüber Protein-Aggregation zu sein, sodass sich das Adressieren dieses Proteins mit Kleinmolekülen als sehr schwierig gestaltet. Als antibakterielle Zielstruktur von Kleinmolekülen ist das Protein demnach abschließend weniger geeignet. Neben dem in Eukaryonten vorkommenden PRORP-Enzym wurde eine andere Protein-basierte RNase P in Aquifex aeolicus (Aquifex aeolicus RNase P, AaRP) und verwandten hyperthermophilen Bakterien der Familie Aquificaceae identifiziert. Wie PRORP gehört auch AaRP zu den Metallonukleasen mit PIN (PilT N-Terminus) -Domäne, obwohl es einer anderen Untergruppe zugeordnet wird. Das monomere Protein ist verhältnismäßig klein (~23 kDa), oligomerisiert letztlich aber zu einem ~280 kDa großen Dodekamer. Mithilfe bioinformatischer Recherchen konnten zudem Homologe von AaRP, die als HARPs (Homologs of Aquifex RNase P) bezeichnet werden, vor allem in hyperthermophilen Bakterien und vielen Archaeen identifiziert werden. Eines dieser HARPs, das Thermodesulfatator indicus HARP, wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Dabei stand die Frage im Vordergrund, welche Regionen des prä-tRNA-Substrats für die Substraterkennung von entscheidender Bedeutung sind. Die enzymkinetische Testung von Substratvarianten der prä-tRNAGly ergab, dass in einem Substrat, welches lediglich aus intaktem Akzeptorstamm und T-Arm mit 5'-Flanke und 3'-CCA-Ende besteht, die wichtigen Determinanten für die Substraterkennung vorhanden sind. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass weder die 5'-Flanke noch das 3'-Ende der prä-tRNA an für die Prozessierung essentiellen Enzyminteraktionen mit dem Thermodesulfatator indicus HARP beteiligt sind. Dies deutet auf eine gewisse Ähnlichkeit zum PRORP-Enzym aus Arabidopsis thaliana hin, das im Gegensatz zur bakteriellen, RNA-basierten RNase P nicht mit der 5'-Flanke und dem 3'-CCA-Ende interagiert. Allerdings scheint der für das PRORP-Enzym bereits beschriebene Längenmess-Mechanismus von Akzeptorstamm und T-Arm bei dem Thermodesulfatator indicus HARP deutlich relaxiert, sodass die Spaltstelle bei der Verlängerung des T-Stamms an das Ende der Akzeptorstamm-Helix verschoben wird.

Summary:
Ribonuclease P (RNase P) is an essential 5'-precursor-tRNA (pre-tRNA) processing enzyme in all domains of life. The architectural diversity of RNase P enzymes is unique. In Bacteria, Archaea, and in the nuclei and organelles of many Eukarya, RNase P is a complex consisting of a catalytic RNA subunit and a varying number of proteins (one protein in Bacteria, at least four in Archaea, and up to ten in Eukarya). In addition, a variant of protein-only RNase P (PRORP) lacking an RNA subunit has been identified in human mitochondria and subsequently in terrestrial plants and some protists. As the prokaryotic and eukaryotic RNase P holoenzymes differ significantly in their structure, the bacterial RNase P is a promising target for the development of novel antibiotics. The aim of this work was to evaluate, whether the bacterial protein subunit can be addressed with small molecules. Two published RNase P inhibitors with a thiosemicarbazide core and an isoflavone skeleton, respectively, served as a starting point. During initial experiments testing the thiosemicarbazide RNPA2000, solubility problems were observed, suggesting that the compound may induce protein aggregation. Small molecule-induced protein aggregation is one major source of false-positive results in drug discovery campaigns. To address this issue, the following control experiments were conducted: (i) addition of detergent to the enzyme kinetic reactions, (ii) variation of RNase P holoenzyme / protein subunit concentration, (iii) determination of the solubility of the potential inhibitor under assay conditions, (iv) analysis of cosedimentation of the protein subunit and the small molecule, and (v) testing for growth inhibition of a Bacillus subtilis strain whose RNase P activity is provided by the eukaryal PRORP. These experiments demonstrated that RNPA2000 is not a specific RNase P inhibitor, but rather induces nonspecific protein aggregation leading to the observed inhibitory effects. Additionally, it could be shown, that the isoflavone iriginolhexaacetate and purpurin, another published RNase P inhibitor, also act as protein aggregators. Therefore, this work revealed that, to date, there are no specific small molecule inhibitors known in literature that bind to the protein subunit. To address the 5'-leader cavity of the protein subunit, completely novel structures were investigated. For this purpose, a structure-based and docking-assisted approach was pursued. Initially, one compound harboring a sulfonate group showed a slight RNase P inhibition. However, during structure-activity relationship studies, solubility problems and protein aggregation reappeared, excluding this class of compounds for further investigations. In summary, the protein subunit of bacterial RNase P is highly susceptible to protein aggregation and addressing this protein with small molecules appears to be very difficult. Consequently, this protein is less suitable as an antibacterial target of small molecules. In addition to the PRORP enzyme found in Eukarya, another protein-based RNase P has been identified in Aquifex aeolicus (Aquifex aeolicus RNase P, AaRP) and related hyperthermophilic Bacteria of the family Aquificaceae. Like PRORP, AaRP also belongs to the PIN (PilT N-Terminus) domain-like superfamily, although it belongs to a different subgroup. The monomeric protein is rather small (~23 kDa), but oligomerizes to a ~280 kDa dodecamer. Within bioinformatic studies homologs of AaRP, termed HARPs (Homologs of Aquifex RNase P), were identified in some predominantly hyperthermophilic Bacteria and many Archaea. A focus of this work was to investigate the HARP of Thermodesulfatator indicus, particularly with regard to substrate recognition. Enzyme kinetic testing of substrate variants of pre-tRNAGly revealed that in the substrate, consisting of an intact acceptor stem and T-arm with 5'-leader und 3'-CCA-end, the important determinants for substrate recognition are present. Furthermore, neither 5'-leader nor 3'-end of the pre-tRNA were shown to be involved in essential enzyme interactions with the Thermodesulfatator indicus HARP. This suggests some similarity to the PRORP enzyme of Arabidopsis thaliana, which, unlike the bacterial, RNA-based RNase P, also does not interact with the 5'-leader and 3'-end of pre-tRNA substrates. However, the length-measuring mechanism of the acceptor stem and T-arm, already described for the PRORP enzyme, appears to be markedly relaxed in the Thermodesulfatator indicus HARP, such that the cleavage site is shifted to the end of the acceptor stem helix upon elongation of the T-stem.


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