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Titel:Kontrolle und Untersuchung des Effektorexports durch das bakterielle Typ 3 Injektionssystem mittels Optogenetik
Autor:Lindner, Florian
Weitere Beteiligte: Diepold, Andreas (Dr.)
Veröffentlicht:2021
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2022/0049
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2022-00496
DOI: https://doi.org/10.17192/z2022.0049
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Publikationsdatum:2022-01-20
Lizenz:https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Optogenetics T3SS Injection, Optogenetik T3SS Injektion

Zusammenfassung:
Das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) ist eine nadelförmige Struktur, die von vielen pathogenen gramnegativen Bakterien genutzt wird, um Effektorproteine vom bakteriellen Zytosol aus in Wirtszellen zu transportieren. Es wurde bereits erfolgreich eingesetzt, um nicht-native Proteine in verschiedene Wirtszellen für unterschiedliche Zwecke, zum Beispiel als Impfung oder zur Immuntherapie, einzuschleusen. Das bakterielle T3SS ist jedoch nicht auf bestimmte Zielzellen beschränkt und injiziert bei Kontakt Effektorproteine in jegliche Art eukaryontischer Zelle. Die fehlende Zielspezifität ist daher ein Haupt-Hindernis für die weitere Entwicklung und Anwendung des T3SS als spezifisches Proteintranslokationstool. Frühere Studien haben gezeigt, dass der zytosolische Komplex des T3SS als hochdynamische Schnittstelle fungiert, in dem Proteine permanent zwischen dem Zytosol und dem T3SS ausgetauscht werden und dass dieser Austausch direkt mit der Funktion der Proteinsekretion zusammenhängt. Diese Erkenntnisse eröffnen eine neue Möglichkeit, die T3SS-Aktivität durch gezielte Sequestrierung und Freisetzung von zytosolischen T3SS-Komponenten zu steuern. Optogenetische Anwendungen, die bisher vor allem in der eukaryontischen Zellforschung etabliert sind, bieten ein neues Instrument zur präzisen Steuerung von Proteininteraktionen mit Licht. In meiner Doktorarbeit habe ich optogenetische Interaktionsschalter in Bakterien eingebaut, um zelluläre Ereignisse gezielt zu steuern. Die Kombination von optogenetischen Interaktionsschaltern mit einer dynamischen und essentiellen zytosolischen Komponente des T3SS ermöglicht eine reversible räumliche und zeitliche Kontrolle der T3SS-Funktion. Dies bildet die Grundlage für unsere Anwendung LITESEC-T3SS (Licht-induzierte Translokation von Effektoren durch Sequestrierung endogener Komponenten des T3SS). Dadurch verbessert sich die Nutzung des T3SS als spezifisches Werkzeug für die Proteineinschleusung in eukaryontische Zellen und ermöglicht eine großflächige Anwendung. In dieser Arbeit zeigen wir, dass die Sekretion, sowohl von nativen Effektorproteinen als auch nicht-nativen „Wunschproteinen“, sowie die Translokation von Proteinen in eukaryontische Wirtszellen in den manipulierten Stämmen effizient durch Licht gesteuert werden kann. Als direkte biologische Anwendung stellen wir den Transport pro-apoptotischer Proteine in Krebszellen vor, die zum gezielten Zelltod führen. Darüber hinaus habe ich das Prinzip der optogenetischen Proteinassoziation und -dissoziation genutzt, um dynamische zelluläre Ereignisse des T3SS, mit Fokus auf der Dynamik des zytosolischen Komplexes und einer möglichen direkten Verbindung zur Funktion, näher zu untersuchen.

Summary:
The type III secretion system (T3SS) is a needle-like structure that is used by many pathogenic Gram-negative bacteria to translocate effector proteins from the bacterial cytosol into host cells. It has been successfully applied to deliver non-native cargo into various host cells for different purposes such as vaccination or immunotherapy. However, bacterial T3SS are not restricted to specific target cells and inject effector proteins into any eukaryotic host cell upon contact. Lack of target specificity is therefore a main obstacle in the further development and application of the T3SS as a specific protein delivery tool. Previous studies have shown that the cytosolic complex of the T3SS acts as a highly dynamic interface, in which parts permanently exchange and shuttle between the cytosol and the T3SS, and that this exchange is directly linked to protein secretion function. These findings raise a new possibility to control the T3SS activity via specific sequestration and release of cytosolic T3SS components. Optogenetic applications, up to now mainly established in eukaryotic cell research, provide a new toolbox to achieve precise control over protein interactions with light. In my PhD work, I incorporated optogenetic interaction switches to bacteria, with the aim to specifically control cellular events. The combination of optogenetic interaction switches with a dynamic essential cytosolic component of the T3SS enables reversible spatial and temporal control of the T3SS function and resulting in the application LITESEC-T3SS (Light-induced translocation of effectors through sequestration of endogenous components of the T3SS). This enhances the use of the T3SS as a specific tool for protein delivery into eukaryotic cells and enables broad applications. We present in this work that the secretion of native effector proteins and non-native cargo proteins, as well as the translocation of cargos into eukaryotic host cells can be efficiently controlled by light in the engineered strains. As a direct biological application, we present the delivery of pro-apoptotic cargos into cancer cells. I further utilized the optogenetic protein association and dissociation principle to investigate dynamic cellular events of the T3SS with focus on the dynamics of the cytosolic complex and its proposed link to effector shuttling and sorting events.


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