Dokument

Zusammenfassung:
Pilze, Bakterien und Pflanzen stellen zahlreiche Sekundärmetabolite her. Ihr Nutzen in dem Produzenten selbst ist oft noch nicht geklärt, dennoch haben viele Sekundärmetabolite eine außerordentliche Bedeutung für die Menschheit. Penicillin hat die Medizin bis heute geprägt, aber auch Lovastatin ist ein Bespiel dafür, welches Potenzial in den Sekundärmetaboliten von Pilzen steckt. Eine interessante Gruppe der Sekundärmetaboliten sind die prenylierten Indolalkaloide. Im Vergleich zur jeweils unprenylierten Substanz kann die Einführung einer Prenylgruppe und die damit verbundene Erhöhung der Lipophilie die biologische Aktivität verbessern. Indolalkaloide können aus tryptophanhaltigen cyclischen Dipeptiden aufgebaut sein. Das Diketopiperazin-Grundgerüst der cyclischen Dipeptide liefert durch die Heteroatome und der Vielseitigkeit in den Seitenketten der Aminosäuren eine ideale Voraussetzung für weitere Modifikationen wie z. B. Acetylierungen, Methylierungen, Cyclisierungen oder Oxidationen. Die hierdurch eingeführten Modifikationen und funktionellen Gruppen führen zu einer Vielfalt an einfachen sowie komplexen Naturstoffen mit interessanten biologischen Aktivitäten. Der Naturstoffgruppe der Ardeemine aus Aspergillus fischeri liegt eine Fumiquinazoline (FQ) Tripeptidgrundstruktur aus Antranilsäure, D-Ala und L-Trp zugrunde. Ein sehr effizienter Biosyntheseweg bestehend aus der NRPS ArdA und der Prenyltransferase ArdB führt zu einem hexacyclischem System (Ardeemin) und die Acetyltransferase ArdC bildet anschließend 5 N Acetylardeemin. Beide Strukturen, Ardeemin und 5 N Acetylardeemin, weisen eine biologische Aktivität als Multi-Drug-Resistance Exportpumpeninhibitor auf. Aufgrund der pharmazeutisch relevanten und vielversprechenden Aktivitäten als Chemotherapeutika sind Fumiquinazoline sowie verwandte Strukturen seit Jahren Teil der Forschung. Durch den Einsatz der Prenyltransferasen für cyclische Dipeptide FtmPT1, BrePT, CdpNPT, CdpC3PT und AnaPT gelang es im Rahmen der vorliegenden Arbeit 14 verschiedene Ardeemin FQ und ent Ardeemin FQ Derivate zu identifizieren und diese mittels LC-MS sowie NMR-Analyse zu charakterisieren. Die Enzyme katalysierten den Transfer der Prenyleinheit an insgesamt sechs unterschiedlichen Positionen N1, C2, C3, C5, C6 und C7. Ardeemin FQ wurde mit Umsätzen von bis zu 77% sehr viel besser akzeptiert als das Enantiomer ent-Ardeemin FQ mit Gesamtumsätzen von maximal 22%, die sich meist auch auf mehreren Produkten verteilen. In einem weiteren Projekt wurde durch die zielgerichtete Mutagenese 5-DMATS und FgaPT2 Mutanten hergestellt, die zur Substratherstellung von C5-prenyliertem cyclo-L-Trp-L-Pro eingesetzt werden sollten. Trotz der erfolgreich hergestellten Mutanten 5-DMATS_R243L, 5 DMATS_R243L_L327G sowie FgaPT2_R244L_Y398F konnte entweder kaum Aktivität oder nur wenig von dem gewünschten Produkt detektiert werden. Parallel zu diesen Mutanten wurde das mehrfachprenylierende Enzym EchPT2 mutiert mit dem Ziel die Mehrfachprenylierungen zu steuern und die Akzeptanz gegenüber dem Donor GPP zu erweitern. Die erfolgreich hergestellten Mutanten EchPT2_A404W, EchPT2_A404F, EchPT2_A404Y und EchPT2_A404L zeigten keinerlei Aktivität gegenüber revers C2 prenyliertes cyclo-L-Trp-L-Pro, revers C2-prenyliertes cyclo-L-Trp-L-Ala oder Tryprostatin B, allerdings konnte bei EchPT2_A404Y mit dem unprenyliertem Substrat cyclo-L-Trp-L-Pro zwei Produktpeaks detektiert werden. Die Mutante EchPT2_L334G katalysiert den Transfer von GPP auf revers C2-prenyliertes cyclo-L-Trp-L-Pro mit moderatem Gesamtumsatz von 14% verteilt auf mindestens drei Produkten. Für das Projekt der heterologen Expression der Cytochrom P450 (CYP) Gene ftmP450-1 bzw. ftmP450-2 aus Neosartorya fischeri in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) zur Untersuchung der Substratspezifität der CYP Enzyme, wurden u. a. prenylierte cyclo-L-Trp-L-Pro Derivate für die Zufütterung benötigt. Die prenylierten Substanzen wurden entweder als Co-Expression der Prenyltransferase zusammen mit den jeweiligen CYP Gene in S. cerevisiae oder chemo-enzymatisch mit rekombiniertem Protein produziert und anschließend zugefüttert. Es wurden die folgenden heterologen Expressionssysteme erfolgreich in S. cerevisiae KO3 etabliert: die Monoexpression von ftmP450-1, ftmP450-2, ftmPT1 und brePT sowie die Co-Expression von ftmPT1 mit ftmP450-1, brePT mit ftmP450-1und ftmPT1 mit ftmP450-2. Für die heterologen Expressionssysteme mit einer Prenyltransferase in S. cerevisiae wurden unprenylierte cyclische Dipeptide zugefüttert, die insgesamt gut umgesetzt wurden. Für die Systeme mit ftmP450-1 bzw. ftmP450-2, allerdings ohne Prenyltransferase, wurden die regulär C2-prenylierten cyclischen Dipeptide wie cyclo-L-Trp-L-Pro (Tryprostatin B), cyclo-D-Trp-D-Pro, cyclo-L-Trp-D-Pro, cyclo-D-Trp-L-Pro, cyclo-L-Trp-L-Leu und cyclo-L-Trp-L-Ala getestet. Dabei zeigte sich ftmP450-2 toleranter gegenüber diesen Substraten als ftmP450-1. Mit ftmP450-1 konnten zusätzlich Substrate getestet werden, die Modifikationen in der Prenyleinheit enthielten, da diese nicht unmittelbar an der Oxidationsreaktion beteiligt ist. Aus diesem Grund war es möglich cyclo-L-Trp-L-Pro Substrate zu testen, die an C4 – C7, C2 revers prenyliert oder an C2 regulär geranyliert waren. Die Verschiebung der Prenylgruppe zu den Positionen C4 – C7 führten zu keiner Umsetzung durch ftmP450-1, allerdings wurden die Substrate, die an C2 eine modifizierte Prenyleinheit trugen, gut umgesetzt und zeigt die Wichtigkeit einer Prenylierung an C2. Diese Produkte von ftmP450-1 wurden mittels LC-MS und NMR-Analyse charakterisiert.

Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten