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Zusammenfassung:
Aufgrund ihrer Inhaltsstoffe ist die Mariendistel (Silybum marianum) besonders für die medizinische Therapie von Bedeutung (Valková 2020). Die Früchte und Extrakte dieser Pflanze werden bereits seit über 2000 Jahren für die Behandlung von Leber- und Gallenwegserkrankungen verwendet (Delmas et al. 2020). Darüber hinaus zeigt die Hauptwirksubstanz Silymarin eine natürliche antiinflammatorische Aktivität (Corchete 2008) sowie ein hemmendes Potential gegen verschiedene Krebsarten (Won et al. 2018). Silymarin ist ein Flavanonollignan-Gemisch aus mehreren Regioisomeren und Diastereomeren. Sie werden durch oxidative Kopplung einer Flavonoid- (Taxifolin) und einer Phenylpropanoid-Einheit (Coniferylalkohol) gebildet. Bei der Reaktion handelt es sich vermutlich um eine radikalische Kopplung (Bernards 2010), die zunächst eine Radikalbildung erfordert, welche möglicherweise durch eine Laccase oder eine Peroxidase (POD) katalysiert wird (Poppe und Petersen 2016, Bijak 2017). Danach könnten dirigierende Proteine (DIR) die regio- und stereospezifische Kopplung, die zur Bildung der einzelnen Regioisomere und Diastereomere führt, vermitteln (Pickel und Schaller 2013). Die Biosynthese beider Vorläufereinheiten erfolgt mit Hilfe mehrerer Enzyme des Phenolstoffwechsels. Die Phenylalanin Ammoniak-Lyase (PAL) ist hierbei das erste zentrale Schlüsselenzym bei der Biosynthese von Phenylpropanen und katalysiert eine nicht oxidative Desaminierung des Phenylalanins zu trans-Zimtsäure. Die Chalkonsynthase (CHS) ist ein wichtiges Enzym im Flavonoid-Biosyntheseweg und synthetisiert Naringenin-Chalkon, welches über weitere Reaktionsschritte zu Taxifolin umgewandelt wird. Die Cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) ist das erste Enzym welches Phenylpropanoid-Metabolite in den Monolignol-Weg leitet. Es katalysiert die Umwandlung von 4-Cumaroyl-, Feruloyl- und Sinapoyl-CoA mit Hilfe von NADPH zu 4-Cumaraldehyd, Coniferaldehyd und Sinapaldehyd. Im letzten Schritt des Monolignol-Biosyntheseweges bildet die Coniferylalkohol Dehydrogenase (CAD) in Abhängigkeit von NADPH aus Coniferaldehyd Coniferylalkohol. Diese Enzyme sowie der Kopplungsmechanismus selbst sind in der Mariendistel (Silybum marianum) bisher noch nicht untersucht worden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die sekretorische Klasse III Peroxidase, sowie zwei dirigierende Proteine aus der Mariendistel heterolog exprimiert werden. Aufgrund der verstärkten Anwesenheit von Signalpeptiden und mehreren Glykosylierungsstellen, konnte trotz mehrfacher Methodenoptimierung keine erfolgreiche Expression der Gene verzeichnet werden. Im Gegensatz hierzu konnten jedoch PAL, CHS, CCR und CAD erfolgreich in Escherichia coli heterolog exprimiert werden. Die Mariendistel besitzt zwei PAL-Isoformen mit einer Molekülmasse zwischen 75 und 100 kDa. Proteinbiochemische Charakterisierungen ergaben Affinitäten zu L- und D Phenylalanin und L Tyrosin. Beide PALs besitzen ein Temperaturoptimum von 60 °C und ein pH-Optimum von 8,5 und 9,5. Für L Phenylalanin konnten Km-Werte von 12 und 35,2 µM, für D Phenylalanin von 146 und 236 µM und für L-Tyrosin von 2,4 und 2,6 mM ermittelt werden. Die CHS dagegen besitzt eine Proteinmasse zwischen 63 und 75 kDa. Das Enzym hat sein pH-Optimum bei pH 7,7. Das Temperaturoptimum konnte auf 40 °C bestimmt werden. Für 4 Cumaroyl-CoA konnte ein Km-Wert von 1,48 µM und für Malonyl-CoA ein Km-Wert von 12 µM bestimmt werden. Ein weiteres in dieser Arbeit charakterisiertes Enzym ist die CAD. Über die Gelelektrophorese konnte eine Proteinmasse von etwa 40 kDa ermittelt werden. Proteinbiochemische Charakterisierungen ergaben ein pH-Optimum bei pH 9,1. Das Temperaturoptimum konnte auf 55 °C bestimmt werden. Der Km-Wert für Coniferylalkohol beträgt 25 µM und für das Cosubstrat (NADP) 3,2 µM. Als letztes der charakterisierten Enzyme ist die CCR zu nennen. Dieses monomere Enzym besitzt ein Molekulargewicht zwischen 35 kDa und 48 kDa und akzeptiert mehrere Substrate: Feruloyl-CoA, gefolgt von Sinapoyl-CoA, 4 Cumaroyl-CoA und Caffeoyl-CoA. Das pH-Optimum konnte auf pH 6,5 und das Temperaturoptimum auf einen Bereich zwischen 29 °C und 34 °C festgelegt werden. Der Km-Wert für Feruloyl-CoA liegt bei 15 µM, für Sinapoyl-CoA bei 21,3 µM, für NADPH bei 23 µM und für NADH bei 68 µM. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit mehrere Schlüsselenzyme aus dem Phenolstoffwechsel aus Silybum marianum identifiziert und heterolog exprimiert werden. Darüber hinaus konnten wichtige Parameter erhoben werden und so tiefere Einblicke und Erkenntnisse in die biochemischen Eigenschaften der ausgewählten Schlüsselenzyme gewonnen werden. Diese Ergebnisse bieten eine gute Grundlage für weitere Untersuchungen des pflanzlichen Phenylpropanoid-Biosynthesewegs in der Mariendistel.

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