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Zusammenfassung:
Arrestine sind eine kleine Familie von vier Proteinen, die eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) spielen. Neben ihrer Funktion in der Desensibilisierung des G-Protein-Signalwegs sind sie auch für die Internalisierung aktivierter GPCRs zuständig. Je nachdem, ob Arrestin dabei am Rezeptor gebunden bleibt oder abdissoziiert, werden GPCRs in zwei Klassen eingeteilt. Klasse-A-Rezeptoren wie der b2AR werden nach einer transienten Interaktion mit Arrestin alleine in Endosomen transportiert, wohingegen Klasse-B-Rezeptoren wie der AT1R oder PTHR stabile Komplexe mit Arrestinen bilden und gemeinsam ins Zellinnere co-internalisieren. Die Ursache für das unterschiedliche Internalisierungsverhalten verschiedener Rezeptoren mit Arrestinen ist bisher nicht abschließend erforscht und wurde daher in dieser Arbeit näher untersucht. Bislang wird in diesem Zusammenhang vermutet, dass eine langanhaltende Ubiquitinierung des Arrestins, die nur durch Klasse-B-Rezeptoren induziert wird, für die Co-Internalisierung von Arrestin entscheidend ist. Deshalb war es im ersten Teil dieser Arbeit das Ziel, die Co-Internalisierung des Arrestins mit Klasse-B-Rezeptoren durch die Elimination von Lysinresten, an die Ubiquitin üblicherweise geknüpft wird, zu verhindern. Den Lysinen 11 und 12 in Arrestin-3 wird bisher eine wichtige Rolle für die Internalisierung von Arrestin zugeschrieben, da deren Austausch durch Arginine (KK11RR) dazu führt, dass diese Doppelmutante nicht mehr mit dem AT1R in die Zelle internalisiert (Shenoy und Lefkowitz, 2005). Außerdem interagiert sie nur noch transient mit weiteren Klasse-B-Rezeptoren (Zindel, 2015). Da Docking-Untersuchungen jedoch zeigen konnten, dass die eingefügten Arginine durch intramolekulare Wechselwirkungen die inaktive Konformation von Arrestin stabilisieren, wurde versucht, diesen Effekt der KK11RR-Mutation durch das zusätzliche Einfügen destabilisierender Mutationen umzukehren. Dafür wurden einerseits die Interaktionspartner der Arginine zu Alaninen mutiert (ED389AA) und zum anderen die Mutation R170E eingefügt, die Arrestin-3 in eine präaktivierte Konformation bringt (Granzin et al., 2015). Tatsächlich konnte durch die Kombination von KK11RR mit diesen Mutationen erreicht werden, dass diese Arrestin-Mutanten wieder stabile Komplexe mit Klasse-B-Rezeptoren bilden und mit gemeinsam diesen internalisert werden. Außerdem zeigten sowohl Arr3 KK11RR R170E als auch Arr3 KK11RR ED389AA nach der Stimulation des PTHR eine für Klasse-B-Rezeptoren typische stabile Ubiquitinierung, die in ihrem Ausmaß der von Wildtyp-Arrestin entsprach. Somit konnte bestätigt werden, dass Arr3 KK11RR nach dem Einfügen zusätzlicher destabilisierender Mutationen wieder mit Klasse-B-Rezeptoren co-internalisiert und die beiden Lysine 11 und 12 dafür nicht zwingend als Ubiquitinierungsstellen zur Verfügung stehen müssen. Da Arrestin-3 nach der vollständigen Elimination aller potenziellen Ubiquitinierungsstellen durch Austausch aller Lysine durch Arginine kaum noch an GPCRs binden konnte, wurden im nächsten Teil der Arbeit stattdessen nur einzelne nachgewiesene Ubiquitinierungsstellen aus Arrestin-3 entfernt, die durch eine massenspektrometrische Untersuchung und Literaturrecherche identifiziert wurden. Da jedoch alle acht Arrestin-Einzelmutanten weiterhin mit dem PTHR co-internalisierten, wurden als nächstes alle Lysin-zu-Arginin-Mutationen in einem Arrestin vereint. Diese Mehrfachmutante zeigte mit dem PTHR ein sehr variables Internalisierungsverhalten und colokalisierte mit dem Rezeptor nur in manchen Zellen, während der Rezeptor in anderen Zellen alleine in Endosomen aufgenommen wurde. Da der Grund für diesen uneinheitliche Phänotyp nicht geklärt werden konnte, wurde die Anzahl der Mutationen daraufhin schrittweise reduziert, um herauszufinden, welche der Punktmutationen für eine reduzierte Co-Internalisierung der Arrestin-Mutante mindestens kombiniert werden müssen. Dies führte auch zu einem weniger variablen Internalisierungsverhalten mit Klasse-B-Rezeptoren. Letztendlich konnten die relevanten Mutationen auf die Lysine 108 und 178 in Arrestin-3 eingegrenzt werden, da die Arrestin-Doppelmutante Arr3 K108R K178R mit mehreren untersuchten Klasse-B-Rezeptoren nicht mehr in die Zelle aufgenommen wurde. Trotzdem wurde in FRAP-Messungen (Fluorescence recovery after photobleaching) festgestellt, dass Arr K108R K178R mit einem aktivierten Klasse-B-Rezeptor genauso langlebige Komplexe bildet wie Wildtyp-Arrestin, was somit bedeutet, dass die reduzierte Co-Internalisierung von Arr3 K178R K108R nicht auf einer weniger stabilen Bindung der Mutante am Rezeptor beruht. Inwiefern stattdessen tatsächlich die reduzierte Ubiquitinierung von Arr3 K178R K108R verantwortlich ist, konnte in dieser Arbeit jedoch nicht abschließend geklärt werden. Um zu überprüfen, welche Bedeutung posttranslationale Modifikationen für die Co-Internalisierung von Arrestinen mit Klasse-B-Rezeptoren haben, wurde zunächst durch den Inhibitor TAK-243, der die wichtigste E1-Ligase Uba1 hemmt, der Großteil der zellulären Ubiquitinierung blockiert. Die Internalisierung von Arrestin-3 wurde zwar durch die Applikation von TAK-243 nicht beeinträchtigt, jedoch ist nicht gesichert, dass die Ubiquitinierung von Arrestin-3 durch den Inhibitor tatsächlich verhindert wird. Durch den SUMOylierungs-Inhibitor 2-D08 wurde die Co-Internalisierung des Arrestins ebenfalls nicht verhindert, sodass die Ubiquitinierung und SUMOYlierung nach den Ergebnissen dieser Arbeit vermutlich nicht entscheidend für die Internalisierung von Arrestin-3 sind. Im letzten Teil der Arbeit wurde mithilfe verschiedener Agonisten des µOR mit unterschiedlichen Bindungshalbwertszeiten untersucht, ob Liganden, die besonders lange am Rezeptor gebunden bleiben, auch eine stabilere Bindung des Arrestins induzieren. Anhand von FRAP-Experimenten wurde jedoch festgestellt, dass die Austauschrate des Arrestins am µOR durch die unterschiedliche Bindungsdauer der einzelnen Agonisten nicht verändert wurde. Außerdem führten Agonisten mit besonders langer Bindungsdauer weder am µOR noch am b2AR dazu, dass Arrestin mit den Klasse-A-Rezeptoren in die Zelle internalisierte. Daraus kann abgeleitet werden, dass die Affinität von Rezeptoragonisten das Klasse-A oder Klasse-B-Verhalten eines Rezeptors nicht verändert und daher keinen Einfluss auf die Co-Internalisierung von Arrestin hat.

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