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Titel:Der Einfluss der kurzkettigen Fettsäure Valproat auf die T-Zell-vermittelte Immunantwort
Autor:Breidenbend, Carina
Weitere Beteiligte: Visekruna, Alexander (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2021
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2021/0371
DOI: https://doi.org/10.17192/z2021.0371
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2021-03716
DDC: Medizin
Publikationsdatum:2021-11-02
Lizenz:https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Immunologie, Valproat, T-Zellen, Immunology, Krebsimmuntherapie, Valproate, valproic acid, Valproinsäure, cancer immunotherapy, T cells

Zusammenfassung:
Valproinsäure, beziehungsweise ihr Salz Valproat, wird seit mehr als 50 Jahren als Antikonvulsivum eingesetzt und ist das am häufigsten verschriebene antiepileptische Pharmakon in Deutschland. In den letzten Jahren ist diese Substanz aufgrund der Entdeckung ihrer antineoplastischen Wirkungen, wie zum Beispiel der Induktion von Apoptose in Tumorzellen, verstärkt in den Fokus der Forschung gerückt. In diesem Zusammenhang wurde entdeckt, dass Valproat ein potenter Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitor ist. HDACs sind Enzyme, die durch epigenetische Veränderungen verschiedene zelluläre Prozesse wie die Apoptose, Differenzierung und Proliferation modulieren können. Eine Inhibition dieser führt somit zu weitreichenden Veränderungen, und zwar insbesondere in Tumorzellen, in denen HDACs häufig dysreguliert sind. Strukturell gesehen ist die Valproinsäure eine synthetisch hergestellte, verzweigte kurzkettige Fettsäure (SCFA). SCFAs entstehen physiologisch mittels anaerober Fermentation unverdauter Nahrungsbestandteile im Kolon und gelten als Hauptmetabolite des intestinalen Mikrobioms. Unsere Forschungsgruppe hat die Wirkung verschiedener SCFAs wie Butyrat und Valerat auf Inflammation und Karzinogenese intensiv untersucht. Dabei wurde ein weitreichender modulatorischer Einfluss auf das Immunsystem deutlich, dessen Dysregulation zu der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und Tumoren führen kann. Eine besondere Rolle kommt dabei T-Lymphozyten zu, die einen zentralen Pfeiler der adaptiven Immunantwort bilden und entscheidend in Anti-Tumor-Antworten involviert sind. Auf der Basis dieser Erkenntnisse wurden neue Therapieansätze im Sinne einer Modulation des Immunsystems mittels verschiedener Techniken und Substanzen entworfen. Dazu zählt beispielsweise der adoptive Zelltransfer von gentechnisch veränderten chimäre Antigenrezeptor (CAR-)gekoppelten T-Zellen im Rahmen einer Immuntherapie. Die Fragestellung, ob auch Valproat ähnlich immunmodulierend wirken und somit potenziell im Rahmen einer solchen zellulären Immuntherapie zur Bekämpfung von Tumoren eingesetzt werden könnte, sollte in dieser Dissertation systematisch beleuchtet werden. Dazu wurde mit Hilfe eines HDAC-Aktivitätsassays validiert, dass Valproat die HDAC-Aktivität in CD4+ und CD8+ T-Zellen signifikant unterdrücken kann. Mittels zellbiologischer und proteinbiochemischer Methoden wie der Durchflusszytometrie und Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) sollte anschließend der Einfluss der Substanz auf die verschiedenen T-Zellsubtypen in vitro genauer charakterisiert werden. Dazu wurden aus murinen Lymphknoten und Milzen T-Zellen isoliert, in Zellkulturen zu den entsprechenden T-Zellsubklassen differenziert und mit Valproat sowie Valerat behandelt. Wir konnten zeigen, dass in allen betrachteten Linien die Expression des immunstimulierenden Zytokins IFN-γ induziert wurde, was Rückschlüsse auf einen möglichen Phänotypenwechsel hin zu TH1-Zellen bzw. zytotoxischen T-Zellen (CTLs) geben könnte. Zudem wurde in TH17- und TC17-Zellen das in die Tumorprogression involvierte Zytokin IL-17A durch Valproat nahezu vollständig supprimiert, ebenso wie der für regulatorische T-Zellen (Tregs) charakteristische Transkriptionsfaktor Foxp3. Gleichzeitig konnten unsere Daten illustrieren, dass CTLs in der Gegenwart von Valproat Schlüsseleffektormoleküle zur Bekämpfung von Tumoren hochregulieren können. Dazu zählt neben dem Zytokin IFN-γ auch das für die Apoptoseeinleitung in Tumorzellen essentielle Granzym B. Als eine grundlegende mechanistische Erklärung konnten wir die HDAC-inhibitorische Wirkung Valproats identifizieren. Eine Kombination dieser Effekte könnte eine Optimierung der Effektorfunktionen von CTLs vermitteln und damit eine noch potentere Tumorbekämpfung ermöglichen. Zusammenfassend werfen unsere Daten ein Licht auf die immunmodulatorischen Einflüsse Valproats und identifizieren diese als eine Substanz mit potenziellem therapeutischen Nutzen im Kontext einer zellulären Immuntherapie. Aktuell wurde ein solcher adoptiver Zelltransfer in einem murinen in vivo Melanommodell mit der „Schwestersubstanz“ Valproats, Valerat, von unserer Arbeitsgruppe in Kooperation mit dem Universitätsklinikum Würzburg etabliert. Dabei konnten bereits Erfolge in der Tumorelimination gezeigt werden, die Hoffnung darauf machen, dass auch Valproat in einem solchen Kontext erfolgreich eingesetzt werden könnte. In zukünftigen Studien sollte dieser Ansatz näher beleuchtet werden.

Summary:
Valproic acid, or its salt valproate, has been used as an anticonvulsant for more than 50 years and is the most commonly prescribed antiepileptic pharmaceutical in Germany. In recent years, this substance has increasingly become the focus of research due to the discovery of its antineoplastic effects, such as the induction of apoptosis in tumor cells. In this context, it was discovered that valproate is a potent histone deacetylase (HDAC) inhibitor. HDACs are enzymes that can modulate various cellular processes such as apoptosis, differentiation and proliferation through epigenetic changes. Inhibition of these thus leads to widespread changes, particularly in tumor cells where HDACs are often dysregulated. Structurally, valproic acid is a synthetically produced branched short-chain fatty acid (SCFA). SCFAs are physiologically produced via anaerobic fermentation of undigested food components in the colon and are considered major metabolites of the intestinal microbiome. Our research group has intensively studied the effect of various SCFAs such as butyrate and valerate on inflammation and carcinogenesis. This has revealed a wide-ranging modulatory influence on the immune system, for which it is known that dysregulation can lead to the development of autoimmune diseases and tumors. A special role is played by T-lymphocytes, which are form a central column of the adaptive immune response and are crucially involved in anti-tumor responses. Based on these findings, new therapeutic approaches have been designed in terms of modulating the immune system using various techniques and substances, for example in the context of immunotherapy using adoptive cell transfer of genetically engineered chimeric antigen receptor (CAR)-coupled T cells. This led us to ask whether valproate could also have a similar immunomodulatory effect and thus potentially be used in the context of such cellular immunotherapy to combat tumors. This should be systematically elucidated in this dissertation, since the influence of valproate on different subtypes of T lymphocytes has not yet been fully clarified. To this end, an HDAC activity assay validated that valproate can significantly suppress HDAC activity in CD4+ and CD8+ T cells. Cell biological and protein biochemical methods such as flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) were then used to further characterize the influence of the substance on the different T cell subtypes. For this purpose, T cells were isolated from murine lymph nodes and spleens, differentiated to the corresponding T cell subtypes in cell cultures and treated with valproate as well as valerate. We demonstrated that in all lines considered expression of the immunostimulatory cytokine IFN-γ was induced, which could provide conclusions about a possible phenotype switch toward TH1 cells or cytotoxic T cells (CTLs). Moreover, in TH17 and TC17 cells, the cytokine IL-17A involved in tumor progression was almost completely suppressed by valproate, as was the transcription factor Foxp3 characteristic of regulatory T cells (Tregs). At the same time, our data illustrated that CTLs can upregulate key effector molecules to combat tumors in the presence of valproate. These included the cytokine IFN-γ as well as granzyme B, which is essential for apoptosis initiation in tumor cells. We identified the HDAC inhibitory effect of valproate as a basic mechanistic explanation. A combination of these effects could mediate optimization of the effector functions of CTLs, allowing even more potent tumor targeting. In summary, our data shed light on the immunomodulatory influences of valproate and identify it as a compound with potential therapeutic utility in the context of cellular immunotherapy. Currently, such an adoptive cell transfer has been established in a murine in vivo melanoma model with valproate's "sister substance", valerate, by our research group in cooperation with the University Hospital of Würzburg. Successful tumor elimination has already been demonstrated, raising hopes that valproate may also be used successfully in such a context. This approach should be further investigated in future studies.


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