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Titel:Aktivierung und Deaktivierung von Cryptochrom 1 aus Arabidopsis thaliana
Autor:Niemann, Nils
Weitere Beteiligte: Batschauer, Alfred (Prof. Dr. )
Veröffentlicht:2021
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2021/0242
DOI: https://doi.org/10.17192/z2021.0242
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2021-02429
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Publikationsdatum:2022-02-03
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Blaulicht, Cry1, Cryptochrome, BIC,, Cry1, blue light, Blue-light inhibitors of cryptochromes, photoreceptor, Photorezeptor, Reaktive Sauerstoffspezies, Cryptochromes, reactive oxygen species, Kryoelektronenmikroskopie, cryogenic electron microscopy, ROS, CryoEM, ROS

Zusammenfassung:
Cryptochrome und Photolyasen sind Flavoproteine, welche die Cryptochrome/Photolyasen-Superfamilie (CPF) bilden. Auch wenn alle CPFs eine hohe Sequenz- und Struktur-Ähnlichkeit zeigen, unterscheiden sie sich dennoch in ihrer physiologischen Funktion. Im Allgemeinen fungieren Cryptochrome als Blaulicht-Photorezeptoren, wohingegen Photolyasen CPD- oder (6-4)-Schäden in Einzel- und/oder Doppelstrang-DNA reparieren. Die Grenzen zwischen Cryptochromen und Photolyasen sind in manchen Fällen der CPF-Familie allerdings weniger deutlich. CPFs besitzen als katalytisch aktiven Kofaktor FAD, ausgenommen davon sind allein animal type II cryptochromes bei welchen bisher kein FAD als Kofaktor nachgewiesen werden konnte. FAD ist bekannt dafür Blaulicht zu absorbieren und in Anwesenheit von einem externen Reduktionsmittel kann Protein-gebundenes FAD bei Cryptochromen zu FADH° und bei Photolyasen zu FADH- reduziert werden. In Photolyasen wird, um den DNA-Schaden zu reparieren, von dem Blaulicht-aktiviertem FADH-* ein Elektron auf den DNA-Schaden übertragen. In pflanzlichen Cryptochromen induziert FADH° eine Änderung in der Proteinstruktur um diese zu aktivieren. Allerdings ist der molekulare Mechanismus zur Aktivierung von Cryptochromen im Vergleich zum Reparaturmechanismus bei Photolyasen weniger klar. In dieser Arbeit wurden die ersten Schritte im molekularen Mechnismus zur Aktivierung von Cryptochrome 1 (cry1) aus Arabidopsis thaliana untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass cry1 unter Blaulicht-Bedingungen ein Tetramer in vitro bildet. Bei genauerer Untersuchung der notwendigen Bedingungen zur Bildung des cry1 Oligomers konnte festgestellt werden, dass neben Blaulicht und einem Reduktionsmittel auch molekularer Sauerstoff notwendig ist. Diese neue Erkenntnis, lässt die Schlussfolgerung zu, dass nicht FADH° der aktive Zustand von cry1 ist, sondern für die Aktivierung von cry1 die Reoxidierung des Flavins notwendig ist. Durch quantitative enzymatische Assays konnte gezeigt werden, dass cry1 unter Blaulicht die reactive oxygen species (ROS) Superoxid (O2·-) und Wasserstoffperoxid (H2O2) produziert. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit ebenfalls die ROS-induzierte Oligomerisierung von cry1 im Dunkeln nachgewiesen werden. Über die physiologische Bedeutung dieser Beobachtung kann bisher nur spekuliert werden, allerdings könnte dies auf einen neuen Redox-regulierten Mechanismus von cry1 hinweisen und cry1 nicht nur als Blaulicht-Photorezeptor sondern auch als Rezeptor des Redoxpotentials fungieren. In Kooperation mit Dr. Stephan Bohn, Dr. Thomas Heimerl, Dr. Jürgen Plitzko, Dr. Gert Bange und Dr. Jan Schuller konnten wir eine CryoEM-Struktur des Blaulicht-aktivierten Tetramers von cry1 erhalten.

Summary:
Cryptochromes and photolyases are flavoproteins which belong to the Cryptochrome/Photolyase-Superfamily (CPF). Even though all CPFs show a high sequence and structure similarity they can be distinguished by their physiological functionality. Generally, cryptochromes function as blue-light photoreceptor, while photolyases repair CPD- or (6-4)-DNA damages in single and/or double stranded DNA. However, the borders between the classes of proteins inside of the CPF can be blurred over the different organisms in which they are occurring. Except of animal type II cryptochromes, CPFs contain FAD as redox active cofactor. The FAD is known to absorb blue-light and in combination with an external reducing agent it is reduced to FADH° in cryptochromes or FADH- in photolyases. In photolyases the blue-light activated FADH-* transfers its electron to the DNA leasion, which is essential for DNA repair. In cryptochromes formation of the FADH° is proposed to lead to a conformational change, but the molecular mechanism is less clear. This work focused on the very early steps of the molecular activation mechanisms of cryptochrome 1 (cry1) from Arabidopsis thaliana. It could be shown that cry1 forms a tetrameric structure under blue-light condition in vitro. By investigating the dependencies of the cry1 oligomer formation it turned out that beside blue-light and an external reducing agent also molecular oxygen is required. This novel finding led to the conclusion that not FADH° is the active FAD state but the reoxidation of this cofactor is crucial for the cry1 activation. Through enzymatic assays for superoxide (O2·-) and hydrogenperoxide (H2O2) activities it could be also shown that cry1 produces reactive oxygen species (ROS) in the presence of blue-light. Interestingly, this work also proofed that cry1 oligomere can be received by external ROS species without blue-light. About the physiological relevance of this finding can only be speculated, but a novel mechanism of redox-regulation for cry1 is feasible. In cooperation with Dr. Stephan Bohn, Dr. Thomas Heimerl, Dr. Jürgen Plitzko, Dr. Gert Bange and Dr. Jan Schuller we were able to obtain a cryoEM structure of the blue-light activated tetrameric complex of cry1. Blue-light inhibitor of cryptochromes (BICs) are proteins which were discovered recently by Wang et al. in 2016. In Arabidopsis thaliana BIC1 and BIC2 are responsible for inhibiting cry1 and cry2. In this study BIC1 was extensively studied to reveal the mechanism how it inhibits cry1. It could be shown that BIC1 has peroxidase activity and contains a covalently bound heme cofactor in vitro. Besides its peroxidase activity BIC1 promotes the monomerization of cry1 under blue-light conditions and in the dark. Taken both mechanisms together they utilize BIC1 as a potent inhibitor of cry1.


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