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Titel:Analytik und Synthese von Pyrrol-Schwefelverbindungen der Gattung Allium sowie deren Verwendung in der Biosensorik
Autor:Rüger, Fabian
Weitere Beteiligte: Keusgen, Michael (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2020
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2021/0215
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2021-02155
DOI: https://doi.org/10.17192/z2021.0215
DDC: Chemie
Publikationsdatum:2021-05-06
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Pyrrolchemie, Polypyrrol, organic thiocyanates, small molecule SPR, Pyrrole chemistry, biosensors, Thiocyanate, polysac, disulfides, surface modification, Polysacchar, Polysaccharide, Elektropolymerisation, Biosensor, electropolymerization, Biosensoren,Oberflächenmodifikation, Disulfide, Elektrochemische Polymerisation, organische Thiocyanate, Oberflächenplasmonresonanz, polypyrrole, Disulfide, Kleinmolekül-SPR, Nanopartikel

Zusammenfassung:
Mit über 850 Arten ist die Gattung Allium eine der bekanntesten Gattungen. Insbesondere in der Untergattung Melanocrommyum wurden zahlreiche interessante Verbindungen isoliert. So wurde in A. stipitatum Pyridinyl-N-oxide gefunden; Marasmin, hauptsächlich aus südafrikanischen Tulbaghia-Arten bekannt, wurde aus A. suworowii isoliert. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Charakterisierung eines roten Pigments, dass von einigen Arten der Untergattung Melanocrommyum bei Gewebeschäden, durch Alliinasereaktion von Pyrrol-2-cysteinsulfoxid, gebildet wurde. Obwohl zwei Veröffentlichungen die Struktur und mögliche Substrate beschreiben, sind aufgrund früherer Ergebnisse des Arbeitskreis Keusgen konkrete Zweifel an der Korrektheit beider Strukturen aufgekommen. Das zweite Ziel war die Synthese dieser Verbindung sowie biosensorischer Messungen, um die Verbindung hinsichtlich ihrer Oxidationsempfindlichkeit und Polymerisationsneigung zu charakterisieren. Die dritte Komponente der Forschungsarbeit, die während der Promotion durchgeführt wurde, war die Entwicklung neuartiger Oberflächenmodifizierungsverfahren. Diese wurde hierbei stark durch die Gattung Allium, beziehungsweise die darin vorkommenden Naturstoffe wie Fructane und Pyrrolverbindungen, inspiriert. Kristallisationsexperimente des roten Farbstoffs zeigten, dass die zuvor veröffentlichten Strukturen nicht korrekt waren. Es wurde bestätigt, dass die Struktur vier „Pyrroleinheiten“ enthält, welche zwei Bipyrroleinheiten bilden, die ihrerseits durch Disulfidbrücken verbunden sind. Für das Zielmolekül wurde eine einfache Eintopfsynthese entwickelt, für die die Edukte gut zugänglich sind. Durch alkalische Hydrolyse und Disproportionierung von 2-Thiocyanatopyrrol wurde (biomimetisch) das Pyrrolyl-2-thiosulfinatopyrrol in geringen Konzentrationen gebildet, das nach mehreren Kondensationsschritten zum roten Farbstoff führte. Bei der Optimierung der Syntheseroute wurde eine Reaktion mehrerer 2-Thiocyanatopyrrole entdeckt. Es konnte gezeigt werden, dass durch Hydrolyse drei verschiedener Thiocyanatopyrrole in alkoholischen Lösungsmitteln die S-alkylierten Produkte sowie Disulfide in akzeptablen Ausbeuten isolieren lassen. Für alle Substrate, die in alkalischen, alkoholischen Lösungsmitteln hydrolysiert wurden, konnten auch Carbonimidothioate nachgewiesen werden. Die Polymerisationsneigung von Pyrrolverbindungen führte zur einer Oberflächenmodifizierung mittels N-substituierten-Pyrrol / Pyrrol-Copolymeren. Oberflächen-Plasmon-Resonance- (SPR) –Studien dieser Oberflächen, zeigten einen hohen Grad an Kompatibilität mit bestehenden Protokollen. EDC / NHS-Aktivierung und kovalente Immobilisierung von Biomolekülen sowie adsorptive Methoden waren aufgrund der Vielseitigkeit dieser Methode möglich. Ein weiteres Merkmal der Copolymere war die hervorragende Bindungsaffinität für Polysaccharide wie Mannan. Die anschließende Immobilisierung unter Verwendung des in der Keusgen-Gruppe etablierten Fusionsproteins ConA-Sav, lieferte gute Bindungsraten. Eine Regeneration der Oberfläche unter Verwendung eines komplementären Monosaccharids (α-D-Methylmannopyranosid) war jedoch nur teilweise möglich. Die zweite Methode zur Darstellung neuartiger Oberflächen für biosensorische Anwendungen wurde unter Nutzung der natürlichen Affinität von BSA ((Rinderserumalbumin (BSA)) zu Goldsubstraten entwickelt, was zu einer Gold / BSA / Gold-Nanopartikel-(AuNP) Sandwich-Plattform führte. Tests unter Verwendung eines Antikörpers, der adsorptiv an die Oberfläche der Nanopartikel gebunden wurde, zeigten eine hohe Performance. Die Messungen waren hinsichtlich der Bindungsraten sowohl von BSA als auch Goldnanopartikeln reproduzierbar; Für die Anti-BSA-Deposition auf AuNP wurde ein linearer Zusammenhang zwischen Bindungsrate und Konzentration zwischen 15 µg / ml und 30 µg / ml erhalten. Schließlich wurde eine auf Polysacchariden basierende Oberflächenmodifikation unter Verwendung einiger allgemein verfügbarer Polysaccharide hergestellt: Inulin, Dextran, Arabinogalactan und Pullulan. Die Bindungsraten der verschiedenen modifizierten Glykane (Mercaptoanilin und Carboxymethyl modifiziert) wurden unter Verwendung der SPR bewertet. Sie ergaben unabhängig vom Durchschnittsgewicht der Glykane sehr ähnliche Ergebnisse, was auf eine horizontale statt einer vertikalen Bindung solcher Polyzucker schließen lässt. Die Schichten zeigten eine hohe Affinität für das ConA-Sav-Fusionsprotein und ermöglichten es dem EDC / NHS-Verfahren, beispielsweise BSA, zu immobilisieren und die Anti-BSA-Bindung bestätigte die erfolgreiche Immobilisierung. Obwohl diese Strategie unter Verwendung von modifizierten Glykanen zufriedenstellende Ergebnisse lieferte; sind weitere Forschungen zur Entwicklung eines Spacers zwischen Goldoberfläche und den Polysacchariden Bestandteil aktueller Forschung.

Summary:
With over 850 species, the genus Allium is one of the most prominent genera. Especially in the subgenus Melanocrommyum, numerous exciting compounds have been isolated. For example, noteworthy concentrations of pyridinyl-N-oxides were found in A. stipitatum; marasmin, known chiefly from South African Tulbaghia species, was found in A. suworowii. The aim of this work was the characterization of a red pigment produced by some species of the Melanocrommyum subgenus, upon tissue damage from allinase reaction of pyrrole-2-cysteine sulfoxide. Although two publications describe the structure and potential substrates, because of prior results of the Keusgen group, doubts have arisen concerning the correctness of both structures. The second target was the synthesis of this compound, along with biosensor measurements, to determine the response upon treatment with oxidation agents and subsequent polymerization. The third component of the research, conducted during the Ph.D. thesis, was the development of novel surface modification procedures inspired by the genus Allium, or, more precisely, its several natural products like fructans and pyrrole compounds. Crystallization experiments showed that the previously published structures for the red pigment are not correct. It was confirmed that the chemical structure contains four pyrrole moieties forming two bipyrrole units connected by disulfide bridges. Thus, the substance is closely related to porphyrins but shows a distinct step-like structure. A simple one-pot synthesis for the target molecule, involving easily to prepare educts, was developed. Alkaline hydrolysis of 2-thiocyanato-pyrrole was used to create a biomimetic synthesis yielding pyrrolyl-2-thiosulfinato-pyrrole in low concentrations, finally leading to the red pigment after several condensation steps. A novel reaction concerning several 2-thiocyanato-pyrroles was discovered during the optimization of the red pigment synthesis. It was shown that after hydrolysis of three different thiocyanato-pyrroles in alcoholic solvents, the S-alkylated products and disulfides could be isolated in acceptable yields. This reaction poses an alternative approach to non-N-substituted pyrrole thioethers. For all substrates that were hydrolyzed in alkaline alcoholic solvents, carbonimido-thioates were produced. Inspired by the tendency of pyrrole compounds to polymerize, a novel surface modification, involving N-substituted-pyrrole/pyrrole copolymers was developed. Surface-Plasmon-Resonance-(SPR)-studies conducted with these surfaces did show a high degree of compatibility with existing protocols. EDC/NHS- activation and covalent immobilization of biomolecules were possible due to the versatility of this method. Another trait of the copolymers was the excellent binding affinity for polysaccharides like man-nan. Polar- (carbonic acid) and unipolar- modified copolymers allowed the binding of mannan: the subsequent immobilization and use of the fusion protein ConA-Sav, which was established in the Keusgen group, was one of the primary targets and showed good results. Regeneration of the surface using a complimentary monosaccharide (α-D-methyl-mannopyranoside) was unfortunately only partially possible. The second method for biosensing SPR-surfaces was developed using the natural affinity of bovine serum albumin (BSA) to gold substrates, which led to a gold/BSA/gold nanoparticle-sandwich-platform. Tests, using an antibody bound adsorptively to the surface of the nanoparticles, did show high performance. The measurements were reproducible concerning the binding rates of BSA and gold nanoparticles; the binding-event of anti-BSA showed a linear relationship of binding rate and concentration between 15 µg/mL and 30 µg/mL. Lastly, a polysaccharide-based surface modification was established using some broadly available polysaccharides: inulin, dextran, arabinogalactan, and pullulan. The saccharides were successfully carboxymethylated and modified with 4-mercapto aniline to allow simple modification of gold-SPR-chips. The binding rates of the different modified glycans were evaluated using the SPR-technique. They produced highly similar results, regardless of the average weight of the glycans, suggesting a horizontal instead of a vertical binding of such poly sugars. The layers did show a high affinity for the ConA-Sav fusion protein and allowed EDC/NHS procedure to immobilize e.g., BSA, and anti-BSA binding confirmed successful immobilization. Although this strategy using modified glycans did provide satisfying results; more research is ongoing to develop a spacer between the gold surface and the polysaccharides.


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