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Titel:The coincidence biosensor tubbyCT reveals local phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate synthesis at endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions
Autor:Thallmair, Veronika
Weitere Beteiligte: Oliver, Dominik
Veröffentlicht:2020
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2021/0200
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2021-02001
DOI: https://doi.org/10.17192/z2021.0200
DDC:610 Medizin
Publikationsdatum:2021-06-08
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
ER-PM junctions, lipid transfer, lipid biosensor, phosphoinositides, Phospholipase C, ER-PM junctions, Lipidtransfer, membrane contact sites, tubby, Tubby, Phosphoinositide, Lipidbiosensor, phospholipase C

Summary:
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) plays a prominent role in plasma membrane (PM) physiology. It is implicated in the regulation of a variety of cellular functions including exo- and endocytosis, cytoskeleton anchorage, and ion channel activity. Activation of Gq-coupled receptors induces rapid break-down of PI(4,5)P2 by PLCβ. The thereby generated second messengers I(1,4,5)P3 and diacylglycerol (DAG), in turn also stimulate the resynthesis of PI(4,5)P2. Because its precursor phosphytidylinositol (PI) is synthesized in the endoplasmic reticulum (ER), PI transport to the PM is an essential step in replenishment of PI(4,5)P2. This transport has recently been shown to occur by a non-vesicular mechanism at highly specialized contact sites between both membranes, the ER-PM junctions. These membrane contact sites are mediated by membrane tethering proteins, including the Extended Synaptotagmins (E-Syts) and tightened upon intracellular Ca2+ rise, allowing PI transfer to occur. In my work, I discovered the preferential localization of tubbyCT, a known PI(4,5)P2 recognition domain, to E-Syt3-rich ER-PM junctions. Junctional recruitment is mediated by coincidence detection of E-Syt3 and PI(4,5)P2, as shown by co-localization experiments, co-immunoprecipitations and manipulations of PM PI(4,5)P2 content. These dual binding properties allowed, for the first time, the selective investigation of local PI(4,5)P2 dynamics at ER-PM junctions. Using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy, TubbyCT revealed the unexpected increase of a local PI(4,5)P2 pool at ER-PM junctions, that was dependent on local synthesis, despite concurrent global PI(4,5)P2 consumption by PLCβ. Pharmacological inhibition of PI(4,5)P2 resynthesis revealed that these local PI(4,5)P2 pool dynamics are required for maintenance and tightening of ER-PM contact sites during PLCβ signaling. Together, my data suggest a model of local metabolic turnover of locally supplied PI, i.e. ‘metabolic channeling’ of PI(4,5)P2 production in the PM. Enrichment at ER-PM contact sites was not restricted to the isolated tubby domain, but was likewise observed with the full-length tubby protein and its close relative TULP3. So far, tubby-like proteins (TULPs) have been implicated in delivery of G protein-coupled receptors to primary cilia. My findings suggest an additional role of TULP proteins at ER-PM junctions not previously recognized.

Zusammenfassung:
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI(4,5)P2) ist ein essentielles Signallipid der Plasmamembran (PM) und in viele biologische Prozesse involviert. So spielt es beispielsweise eine wichtige Rolle bei Endo- und Exozytose, bei der Verankerung des Zytoskeletts an der Membran, sowie bei der Regulierung von Ionenkanälen. Die Aktivierung von Gq-gekoppelten Rezeptoren führt zum schnellen Abbau von PI(4,5)P2 durch die Phospholipase C-β (PLCβ), jedoch bedingen die dabei anfallenden sekundären Botenstoffe I(1,4,5)P3 und Diacylglycerin (DAG) auch eine zeitnahe PI(4,5)P2 Resynthese. PI(4,5)P2 wird durch Phosphorylierung aus Phosphatidylinositol (PI) gebildet, welches aus dem ER stammt und die PM durch nicht-vesikulären Lipidtransport erreicht. Dieser PI Transfer stellt einen essentiellen Schritt der PI(4,5)P2 Resynthese dar. Er findet an sogenannten ER-PM Junctions statt, hochspezialisierten Domänen, an denen die ER Membran über Proteine wie beispielsweise die Extended Synaptotagmins (E-Syts) mit der PM verbunden ist. Ein Anstieg an intrazellulärem Ca2+, hervorgerufen zum Beispiel durch Aktivierung der PLCβ, führt zu einem verminderten Abstand der beiden Membranen, was letztendlich den PI Transfer ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit habe ich die bevorzugte Assoziation des bekannten PI(4,5)P2 Sensors TubbyCT mit E-Syt3-enthaltenden ER-PM Junctions herausgefunden. Die Rekrutierung von TubbyCT an die ER-PM Junctions erfolgt durch Koinzidenz-Bindung an E-Syt3 und PI(4,5)P2, was ich unter anderem durch Kolokalisationsexperimente, Ko-Immunpräzipitationen und Manipulationen des PI(4,5)P2 Gehalts der PM gezeigt habe. Aufgrund der Koinzidenz-Bindungseigenschaften von TubbyCT eignet sich der Sensor zur Messung lokaler PI(4,5)P2 Dynamiken an ER-PM Junctions. So konnte zum ersten Mal, mittels Interner Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF) Mikroskopie des fluoreszenzmarkierten TubbyCT, eine lokale Produktion von PI(4,5)P2 an ER-PM Junctions, während gleichzeitig stattfindender globaler Hydrolyse des Lipids durch die PLCβ, gezeigt werden. Pharmakologische Inhibierung der PI(4,5)P2 Resynthese machte des Weiteren deutlich, dass diese lokale PI(4,5)P2 Population für den Erhalt der ER-PM Junctions, sowie für die Reduktion des Abstands der beiden Membranen während der Aktivierung der PLCβ nötig ist. Zusammenfassend deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass PI für die Produktion von PI(4,5)P2 durch einen, an ER-PM Junctions assoziierten, Multienzymkomplex geschleust wird, also eine Metabolit-Kanalisierung während der PI(4,5)P2 Synthese stattfindet. Neben TubbyCT reichert sich auch das Volllängenprotein Tubby, sowie sein naher Verwandter TULP3 an ER-PM Junctions an. Bisher beschränkte sich die Funktion der Tubby-ähnlichen Proteine (TULPs) auf die Rekrutierung G-Protein gekoppelter Rezeptoren in Primärzilien, meine Daten jedoch deuten auf eine weitere, konservierte Funktion der TULPs an ER-PM Junctions hin.


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