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Titel:Remodelling regulates the heterochromatin of retrotransposons in mouse embryonic stem cells
Autor:Sachs, Parysatis
Weitere Beteiligte: Mermoud, Jacqueline (Dr.)
Veröffentlicht:2021
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2021/0197
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2021-01974
DOI: https://doi.org/10.17192/z2021.0197
DDC: Medizin
Publikationsdatum:2021-06-08
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Chromatin in Stammzellen, Chromatin, ERV, Chromatin remodelling in stem cells, ERVs, Remodelling, SMARCAD1, stem cells, repression, KAP1, ES cells, retrotransposons

Summary:
Chromatin remodellers slide, assemble, eject or edit nucleosomes influencing chromatin structure, DNA accessibility and transcriptional programmes. The SNF2-like remodeller SMARCAD1 is conserved from yeast to human cells and is highly expressed in mouse embryonic stem cells. Upon its loss cells lose their pluripotent phenotype but its function in ES cells is not known. In order to understand the role of SMARCAD1 in mouse embryonic stem cells a robust ChIP-seq protocol was developed for the tagged and endogenous protein in wild-type and knockdown cell lines. SMARCAD1 binding sites were found predominantly at intergenic sites genome-wide, and overlap with repressive histone modifications. Among the chromatin-bound proteins discovered enriched with SMARCAD1 binding sites is KAP1 (KRAB-associated protein 1; Krüppel-associated box), a critical factor for the silencing of endogenous retroviral elements (ERVs) in mouse ES cell, the histone methyltransferase SETDB1 (SET Domain Bifurcated Histone Lysine Methyltransferase I), and the histone variant H3.3. Taken together, the discovered binding sites provide new understanding of SMARCAD1 function in ES cells and illustrate that in the open chromatin environment characteristic of the pluripotent state, SMARCAD1 is associated with transcriptional repression. An unresolved issue is how SMARCAD1 associates with its binding sites without a DNA-binding domain and no known domains for recruitment by histone modifications. Candidate SMARCAD1 targets were investigated and it was discovered that recruitment is dependent on the interaction with KAP1 via the CUE1 (Coupling of Ubiquitin conjugation to ER degradation) domain of SMARCAD1. Sequential ChIP experiments revealed that KAP1 and SMARCAD1 are co-enriched on their shared targets. Among the discovered binding sites of the remodeller SMARCAD1 are endogenous retroviral elements (ERVs) an abundant type of transposable element derived from viral integrations in the germline. ERV expression is tightly controlled by repressive factors as they pose a threat for genome stability. A series of knockdowns and ChIP-qPCR experiments was performed to understand the cooperation and underlying mechanisms of how these factors shape and control ERV heterochromatin. SMARCAD1 was identified as a crucial component; it is required for the association of the KAP1-SETDB1 silencing machinery over class I and II ERVs, and consequently the maintenance of the histone modifications H3K9me3 and H4K20me3. The histone variant H3.3 has a controversial role in ERV control and is similarly reduced upon the loss of SMARCAD1, suggesting SMARCAD1 may be involved in the turn-over of this variant. In summary, heterochromatin organisation is perturbed when SMARCAD1 is not present at ERVs. The presence of H3K9me3 on the other hand is not necessary for SMARCAD1 binding as shown in a SETDB1 knock-down. The assembly of KAP1 and H3K9me3 is rescued by the ectopic expression of wild-type SMARCAD1 but not by an ATPase mutant. Hence, it is the catalytic activity of SMARCAD1 and chromatin remodelling that is required for the silencing of ERVs. The KAP1 interaction mutant had no effect on the association of KAP1 itself but could similarly not restore H3K9me3 emphasizing that SMARCAD1 is required for successful heterochromatin formation on ERVs and identifying chromatin remodelling as a key mechanism of ERV control in mouse ES cells.

Zusammenfassung:
Chromatin-Remodeller können Nukleosomen verschieben, zusammenfügen, ausstoßen oder diese restrukturieren, wobei sie die Chromatinstruktur, die Zugänglichkeit der DNA und die Transkriptionsprogramme der Zelle beeinflussen. Der SNF2-like Remodeller SMARCAD1 ist von Hefe bis zu menschlichen Zellen konserviert und wird in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) von Mäusen stark exprimiert. Bei seinem Verlust verlieren Zellen ihren pluripotenten Phänotyp, allerdings ist die Funktion von SMARCAD1 in Stammzellen nicht bekannt. Um die Rolle von SMARCAD1 in embryonalen Stammzellen zu verstehen, wurde ein robustes ChIP-seq-Protokoll für das getaggte und endogene Protein in Wildtyp- und Knockdown-Zelllinien entwickelt. SMARCAD1-Bindungsstellen liegen überwiegend in intergenen Stellen genomweit und überlappen mit repressiven Histonmodifikationen. Unter den mit SMARCAD1-Bindungsstellen angereicherten Chromatin-gebundenen Proteinen befindet sich KAP1 (KRAB-associated protein 1; Krüppel-associated box), ein kritischer Faktor für die Stummschaltung endogener retroviraler Elemente (ERVs) in Maus-ES-Zellen, die Histonmethyltransferase SETDB1 (SET Domain Bifurcated Histone Lysine Methyltransferase I) und die Histonvariante H3.3. Zusammengenommen liefern die entdeckten Bindungsstellen ein neues Verständnis der SMARCAD1-Funktion in ES-Zellen und veranschaulichen, dass SMARCAD1 in der für den pluripotenten Zustand charakteristischen offenen Chromatin-Umgebung mit Transkriptionsrepression assoziiert ist. Ein ungelöstes Problem ist, wie SMARCAD1 ohne DNA-Bindungsdomäne und ohne bekannte Domänen für die Rekrutierung durch Histonmodifikationen mit seinen Bindungsstellen assoziiert. Verschiedene Kategorien von SMARCAD1 Bindungsstellen wurden untersucht und es wurde entdeckt, dass die Rekrutierung von der Interaktion mit KAP1 über die CUE1-Domäne (Coupling of Ubiquitin conjugation to ER degradation) von SMARCAD1 abhängt. Sequenzielle ChIP-Experimente zeigten, dass KAP1 und SMARCAD1 an ihren gemeinsamen Bindungsstellen zugleich angereichert sind. Unter den entdeckten Bindungsstellen des Remodellers SMARCAD1 befinden sich endogene retrovirale Elemente (ERVs), eine häufig vorkommende Art transponierbarer Elemente, die aus viralen Integrationen in der Keimbahn stammen. Die ERV-Expression wird durch repressive Faktoren streng kontrolliert, da sie sonst eine Bedrohung für die Genomstabilität darstellen. Eine Reihe von Knockdown und ChIP-qPCR-Experimenten wurde durchgeführt, um zu verstehen, wie diese Faktoren ERV-Heterochromatin formen. SMARCAD1 wurde als entscheidende Komponente identifiziert; es ist nötig für die Assoziation der repressiven Faktoren KAP1 und SETDB1 zu ERVs der Klassen I und II und folglich für die Erhaltung von den Histonmodifikationen H3K9me3 und H4K20me3. Die Histonvariante H3.3 spielt eine kontroverse Rolle bei der ERV-Kontrolle und wird beim Verlust von SMARCAD1 reduziert, was darauf hindeutet, dass SMARCAD1 an dem Turnover dieser Variante beteiligt sein könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Heterochromatin-Organisation ist gestört, wenn SMARCAD1 nicht auf ERVs vorhanden ist. Das Vorhandensein von H3K9me3 ist andererseits für die SMARCAD1-Bindung nicht erforderlich, wie in einem SETDB1-Knockdown gezeigt. Die Assemblierung von KAP1 und H3K9me3 wird durch die ektopische Expression von Wildtyp-SMARCAD1, jedoch nicht durch eine ATPase-Mutante gerettet. Daher sind es die katalytische Aktivität von SMARCAD1 und das Chromatin-Remodelling, die für die Stummschaltung von ERVs erforderlich sind. Die KAP1-Interaktionsmutante hatte keinen Einfluss auf die Assoziation von KAP1 selbst, konnte jedoch H3K9me3 ebenfalls nicht wiederherstellen, was zeigt, dass SMARCAD1 für eine erfolgreiche Heterochromatinbildung auf ERVs erforderlich ist. Damit ist die Chromatin-Remodellierung als Schlüsselmechanismus der ERV-Kontrolle in Maus-ES-Zellen identifiziert.


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