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Titel:Analysis of the molecular mechanisms of prestin-mediated cochlear amplification via a cysteine accessibility study
Autor:Hartmann, Julia
Weitere Beteiligte: Oliver, Dominik (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2021
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2021/0168
DOI: https://doi.org/10.17192/z2021.0168
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2021-01685
DDC:610 Medizin
Publikationsdatum:2021-04-21
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
rat prestin, zebrafish prestin, cysteine accessibility study, Cystein Zugänglichkeitsstudie, NLC, SCAM, nicht-lineare Kapazität, Rattenprestin, cochlear amplification, non-linear capacity, NLC, electromotility, prestin, Elektromotilität, SCAM, Zebrabärblingpre, molecu, Prestin, Kochleäre Amplifikation

Summary:
Prestin is the protein being responsible for electromotility in mammals. It is a member of the SLC26 (Solute Carrier) family, which function as anion transporters. In contrast to the other members, mammalian prestin does not function as an anion transporter but produces electromotility. Non-mammalian prestin orthologues such as zebrafish prestin are anion-exchangers with a stoichiometry of 1:1, where a chloride anion is transported in exchange for a divalent anion. Based on the bacterial uracil transporter UraA, a structural homology model of prestin with a 7+7 inverted repeat architecture was predicted. The mechanism of the SLC26-mediated transport is not fully understood. A potential role of this transport mechanism in the electromotile properties of prestin is elusive, but based on the high sequence similarity of transport-capable and electromotile prestin orthologues the idea arose that both are related and electromotility evolved from transport. This is further supported by the finding that the motor protein prestin interacts with and only undergoes conformational rearrangements in the presence of intracellular monovalent anions. Furthermore, it is not completely understood whether electromotile prestin undergoes structural dynamics that are similar to those of transport-capable members of the SLC26 family. The aim of the present study is to elucidate whether the function of the SCL26 transporters and voltage-driven motors follows common structural principles. To achieve this aim, two members of the SLC26 family were chosen as model systems: the non-mammalian zebrafish prestin and the mammalian rat prestin. The method mainly used in this study is a cysteine accessibility study. It allows insights into structures that should change their accessibility to the aqueous medium according to their movement during a transport cycle. The membrane-impermeable MTS reagents were either applied from the intracellular or extracellular side. In rat and zebrafish prestin positions were identified which were sensitive to MTS applications and in consequence accessible. The presumptive anion-binding site and the anion translocation pathway are mainly located in the transmembrane domains 3 and 10. The data here presented are consistent with the structural models derived from experimental structures. Positions within transmembrane domain 10 are mainly accessibly from the intracellular side and positions within transmembrane domain 3 from the extracellular side. Furthermore, there are central positions in zebrafish prestin, which are accessible from both sides. This indicates an alternating-access transport consistent with elevator movement of the core domain. The lack of extracellular access of the homologous positions in rat prestin shows that the extracellular-exposed conformation is not obtained in mammalian prestin. This points towards an incomplete transport mechanism performed by mammalian prestin. The rat prestin mutant V139C is accessible from both sides. This two-sided accessibility suggests an outward movement of the core domain within an incomplete transport transition. This mutant shows that V139 faces the translocation pathway in the inward-open as well as in the occluded conformation and thus stays rigid and does not undergo a conformational rearrangement. An alternating-access transport in elevator mode is characterised by a relatively rigid immobile gate domain, a mobile core domain, which contains the anion-binding site, and a vertical displacement of the bound substrate. The results of the scanning support this mode of transport that was also proposed for a prokaryotic SLC26 family member. While crystal structures record a protein in a certain conformation cysteine labelling provides the opportunity to study the full conformational changes. The model derived from the scanning results present alternate conformations determined by the extracellular accessibilities of positions of the respective prestin orthologue. To what extent the core domain opens to the extracellular side can be deduced by the positions V139 within transmembrane domain 3 in rat prestin and M400 and S400 within transmembrane domain 10 in zebrafish prestin. There is an obvious difference between the alternate conformation of rat and zebrafish prestin. Zebrafish prestin undergoes a full transport cycle from an inward-open to an outward-open conformation, whereas rat prestin alternates between the inward-open and the intermediate (occluded) conformation. The results of the scanning show that the elevator mode of transport is mainly realised by zebrafish prestin. Rat prestin fails to reach the outward-open conformation, thus it performs an incomplete transport mechanism in an elevator-like manner. Additionally, rat prestin V139C shows a combination of mechano- and redox-sensitivity. The activity of rat prestin V139C is dependent on the application of fluid-flow. This flow-dependency of activity seems to be correlated with the microenvironment of the mutant - the more inflexible the side chain the more distinct the flow-sensitivity of activity. On the basis of the presented data the applied fluid-flow does not cause membrane tension in V139C. The mechanosensitivity of V139C seems to be provoked by pure shear stress. Furthermore, it is different from the intrinsic tension-sensitivity of prestin wild type. Finally, the phenomenon of the mechano- and redoxsensitivity could not yet be clarified.

Zusammenfassung:
Prestin ist als das Protein identifiziert worden, welches für die Elektromotilität in Säugetieren verantwortlich ist. Es ist ein Mitglied der SLC26 (Solute Carrier) Familie, dessen Mitglieder als Anionentransporter fungieren. Im Gegensatz zu den anderen Mitgliedern ist das Säugetier-Prestin kein Anionentransporter und generiert stattdessen Elektromotilität. Nichtsäugetier-Prestin Orthologe wie das Prestin des Zebrabärblings sind Anionenaustauscher mit einer Stöchiometrie von 1:1, wobei ein Chloridanion im Austausch gegen ein zweiwertiges Anion transportiert wird. Basierend auf dem bakteriellen Uracil Transporter UraA wurde ein strukturelles Homologiemodell von Prestin mit einer 7+7 „inverted repeat“ Architektur entworfen. Der Mechanismus des SLC26-vermittelten Transports ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Welche Rolle dieser Transportmechanismus für die elektromotilen Eigenschaften von Prestin spielt, ist unklar. Basierend auf der hohen Sequenzhomologie transportfähiger und elektromotiler Prestin Orthologe entstand die Idee, dass beide Mechanismen verwandt sind und Elektromotilität aus einem Transportmechanismus entstanden ist. Dies wird ebenfalls dadurch belegt, dass das Motorprotein Prestin mit intrazellulären monovalenten Anionen interagiert und Konformationsänderungen nur in Anwesenheit dieser Anionen durchführt. Dennoch ist es nicht komplett verstanden, ob elektromotiles Prestin strukturelle Dynamiken durchläuft, welche denen transportfähiger Mitglieder der SLC26 Familie ähneln. Das Ziel der vorgelegten Studie war es aufzuklären, ob die Funktion der SCL26 Transporter und spannungsgetriebener Motorproteine gemeinsamen strukturellen Prinzipien folgt. Um dies zu erreichen, wurden zwei Mitglieder der SLC26 Familie als Modellsysteme ausgewählt: das Nichtsäugetier-Prestin des Zebrabärblings und das Säugetier-Prestin der Ratte. Die hauptsächlich angewandte Methode in dieser Studie war eine Cystein Zugänglichkeitsstudie. Dadurch können Strukturen identifiziert werden, welche ihre Zugänglichkeit zum wässrigen Medium entsprechend ihrer Bewegung während eines Transportzyklus ändern. Die membranundurchlässigen MTS Reagenzien wurden entweder von der intrazellulären oder der extrazellulären Seite appliziert. Im Prestin der Ratte und des Zebrabärblings wurden Positionen identifiziert, welche sensitiv auf Applikationen mit MTS reagierten und folglich zugänglich sind. Die mutmaßliche Anionenbindungsstelle und der Anionentranslokationsweg sind größtenteils in den Transmembrandomänen 3 und 10 lokalisiert. Die hier vorgestellten Daten stimmen mit den aus experimentellen Strukturen abgeleiteten Strukturmodellen überein. Positionen innerhalb der Transmembrandomäne 10 sind hauptsächlich von der intrazellulären Seite zugänglich und Positionen innerhalb der Transmembrandomäne 3 von der extrazellulären Seite. Darüber hinaus gibt es zentrale Positionen im Zebrabärblingprestin, die von beiden Seiten zugänglich sind. Dies deutet auf einen alternierenden Zugang während des Transports (‚alternating-access transport‘) mit einer Aufzugsbewegung (‚elevator movement‘) der Kerndomäne hin. Das Fehlen des extrazellulären Zugangs der homologen Positionen im Rattenprestin zeigt, dass die extrazellulär exponierte Konformation im Säugetierprestin nicht erreicht wird. Dies spricht für einen unvollständigen Transportmechanismus, welchen das Säugetierprestin durchläuft. Die Mutante Rattenprestin V139C ist von beiden Membranseiten zugänglich. Diese zweiseitige Zugänglichkeit spricht für eine Bewegung der Kerndomäne nach außen innerhalb eines unvollständigen Transports. Diese Mutante demonstriert, dass V139 sowohl in der nach innen geöffneten als auch der intermediären (‚occluded‘) Konformation rigide zum Translokationsweg zeigt und keine konformative Umordnung widerfährt. Ein Transport mit abwechselndem Zugang in einer Elevator Weise ist charakterisiert durch eine relative rigide immobile Tordomäne (‚gate domain‘), eine mobile Kerndomäne (‚core domain‘), welche die Anionenbindungsstelle beinhaltet, und eine vertikale Verschiebung des gebundenen Substrates. Das Ergebnis des Scannings unterstützt diese Weise des Transportes, welche ebenfalls für ein prokaryotisches SLC26 Familienmitglied vorgeschlagen wurde. Während Kristallstrukturen ein Protein in einer bestimmten Konformation erfassen, bietet die Cysteinmarkierung die Möglichkeit komplette Konformationsänderungen zu studieren. Das Modell, welches aus den Scanningdaten resultiert, präsentiert alternierende Konformationen, welche durch die extrazelluläre Zugänglichkeit von Positionen des jeweiligen Prestin Orthologs ermittelt wurden. Bis zu welchem Grad sich die Kerndomäne zur extrazellulären Seite öffnet, kann durch die Zugänglichkeit der Positionen V139 innerhalb der Transmembrandomäne 3 des Rattenprestins sowie M400 und S400 innerhalb der Transmembrandomäne 10 des Zebrabärblingprestins hergeleitet werden. Es gibt einen offensichtlichen Unterschied zwischen den alternierenden Konformationen des Prestins der Ratte und des Zebrabärblings. Das Prestin des Zebrabärblings durchläuft einen kompletten Transportzyklus von der nach innen geöffneten bis zur nach außen geöffneten Konformation, wohingegen das Rattenprestin zwischen der innen geöffneten und der intermediären (‚occluded‘) Konformation alterniert. Die Scanningergebnisse zeigen, dass der Elevatortransport primär vom Prestinortholog des Zebrabärblings durchgeführt wird. Das Prestin der Ratte nimmt die nach außen geöffnete Konformation nicht ein und führt dementsprechend einen unvollständigen Transportmechanismus in einer Elevator-ähnlichen Weise durch. Zusätzlich zeigt die Mutante V139C des Rattenprestins eine Kombination aus Mechano- und Redoxsensitivität. Die Aktivität des Rattenprestins V139 ist abhängig von der Applikation eines Fluidstroms. Die Fluss- (‚flow‘-) abhängkeit der Aktivität dieser Mutante scheint mit ihrer Mikroumgebung zu korrelieren – je unflexibler die Seitenkette desto ausgeprägter die Fluss-Abhängigkeit der Aktivität. Basierend auf den hier vorgestellten Daten verursacht der applizierte Fluidstrom keine Membranspannung, sondern Scherspannungen in V139C. Darüber hinaus unterscheidet sich diese Sensitivität von der intrinsischen Spannungssensitivität des Prestin Wildtyps. Letztlich konnte das Phänomen der Mechano- und Redoxsensitivität nicht aufgeklärt werden.


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