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Titel:Funktionelle Charakterisierung der zellulären Rolle des Kandidatengens Valosin containing protein im Pankreaskarzinom
Autor:Schimanski, Sven
Weitere Beteiligte: Buchholz, Malte (Prof. Dr)
Veröffentlicht:2021
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2021/0149
DOI: https://doi.org/10.17192/z2021.0149
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2021-01490
DDC:610 Medizin
Publikationsdatum:2021-03-10
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

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Schlagwörter:

Zusammenfassung:
Das duktale Adenokarzinom des Pankreas geht noch immer mit einer sehr schlechten Prognose einher. Die 5-Jahres-Überlebensrate liegt lediglich bei etwa 9 %. Aufgrund häufig fehlender Frühsymptome sowie einer frühen Metastasierung befindet sich die Mehrzahl der Patienten bei Diagnosestellung bereits in einem fortgeschrittenen Stadium. Doch auch die Krankheitsfälle, die in einem Frühstadium diagnostiziert werden und somit operabel sind, weisen eine hohe Mortalitätsrate auf. Dies ist unter anderem darauf zurückzuführen, dass sich das Pankreaskarzinom durch eine ausgeprägte Resistenz gegenüber zytostatischer Therapie auszeichnet. Daher wurde in den letzten Jahren vermehrt an Zielstrukturen innerhalb der Tumorzellen geforscht, welche im Rahmen einer „targeted therapy“ pharmakologische Angriffspunkte zur gezielten Tumortherapie darstellen könnten. Eine potenzielle Zielstruktur ist das Protein „Valosin-containing protein“ (VCP), welches in einer vorangegagenen Arbeit der AG Buchholz in einem shRNA-basierten Screening identifiziert wurde. Es wurde bereits in mehreren Publikationen gezeigt, dass VCP, welches eine zentrale Rolle in der proteasomalen Degradation von Proteinen und Polypeptiden spielt, in zahlreichen Tumorentitäten erhöht und mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. In dieser Arbeit konnte eine statistisch signifikant erhöhte Expression von VCP in Pankreaskarzinomgewebe sowohl gegenüber Gewebeproben bei chronischer Pankreatitis als auch gegenüber gesundem Pankreasgewebe nachgewiesen werden. Mittels qRT-PCR wurde gezeigt, dass durch die drei verwendeten siRNAs in verschiedenen Pankreaskarzinom-Zelllinien ein suffizienter Knockdown der VCP-mRNA möglich war. Via MTT- sowie BrdU-Assays wurde der Einfluss des Knockdowns auf die Zellviabilität sowie die Proliferation der Tumorzellen untersucht. In allen drei verwendeten Zelllinien konnten bei Transfektion mit siRNA1 und siRNA3 eine statistisch signifikante Reduktion der Zellviabilität und der Zellproliferation nachgewiesen werden. Mithilfe von Western Blots konnte Apoptose als Ursache für die Reduktion der Zellviabilität ausgeschlossen werden. Mittels Western Blot konnte gezeigt werden, dass in den Zellpopulationen mit reduzierter Zellproliferation eine deutliche Hochregulierung des Zellzyklusproteins p21 und eine Herunterregulierung von Cyclin D1 erfolgte. Auffällig war, dass die Transfektion mit siRNA2 in keiner der durchgeführten funktionellen Assays einen Effekt auf Zellviabilität oder Zellproliferation hatte. Hierfür wurden Off-Target-Effekte als mögliche Ursache diskutiert. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit mit der Reduktion der Zellviabilität und Zellproliferation zwei potenzielle Wege gezeigt werden, wie die Herunterregulierung der Expression von VCP antitumorale Wirkung entfalten kann. Die Entschlüsselung der genauen molekularen Grundlagen bleibt zukünftigen Versuchen und Analysen vorbehalten.

Summary:
Pancreatic ductal adenocarcinoma still has an extremely poor prognosis. The 5-year survival rate is around 9 %. The disease is often diagnosed in advanced stages, because in many cases there are no early symptoms and PDAC metastasizes early. Yet also cases which are diagnosed in early stages and thus are primarily resectable, show high mortality rates. One of the reasons for this aggressive behavior is its high resistance against chemotherapy. Therefore, within the last years researchers tried to identify cellular structures, which could be targeted by new antineoplastic agents. A potential structure is the protein “Valosin-containing protein” (VCP), which could be identified in an shRNA-based screening in a former dissertation of the AG Buchholz. A central role of VCP in proteasomal degradation, its overexpression in various tumor entities and its association with dismal prognosis were shown in several prior publications. In this dissertation a statistically significant increased expression of VCP in tissue samples of PDAC compared to samples of healthy pancreatic tissue and chronic pancreatitis could be shown. It could be shown that all three used siRNAs led to a sufficient knockdown of VCP-mRNA in various PDAC-cell lines. MTT- and BrdU-assays were used to determine whether this knockdown had influence on the viability and proliferation of the tumor cells. In all three used cell lines a statistically significant decrease of cell viability and cell proliferation could be detected, when cells were transfected with siRNA1 and siRNA3. Apoptosis as a reason of reduced cell viability could be excluded by performing western blots. With the help of Western Blots, a remarkable upregulation of the cell cycle protein p21 and a downregulation of Cyclin D1 could be demonstrated in these cell populations, which showed reduced cell proliferation. It was noticeable, that the functional assays could not detect any effect on cell viability or cell proliferation when the cells had been transfected with siRNA2. Off-target-effects were discussed as one possible reason. Finally, with the reduction of cell viability and cell proliferation this thesis showed two potential ways, how the downregulation of VCP could mediate antitumoral effects. The identification of the exact mocluar mechanisms is part of future experiments and analyses.


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