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Titel:Genome mining-directed discovery of novel 2,5-diketopiperazines from actinobacteria
Autor:Liu, Jing
Weitere Beteiligte: Li, Shu-Ming (Prof. Dr)
Veröffentlicht:2021
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2021/0102
DOI: https://doi.org/10.17192/z2021.0102
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2021-01027
DDC:
Titel(trans.):Genome mining-gestützte Entdeckung neuartiger 2,5-Diketopiperazine aus Actinobakterien
Publikationsdatum:2021-03-31
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Biosynthesis, Genome mining, Actinobakterien, 2,5-Diketopiperazine

Summary:
Natural products derived from cyclodipeptides (CDPs) with a 2,5-diketopiperazine (DKP) skeleton comprise an important class of secondary metabolites, especially indole alkaloids derived from tryptophan-containing CDPs, which are widespread in fungi, bacteria, and plants. They play vital roles in drug discovery and development owing to their significant biological and pharmacological activities. In nature, the DKP cores can be generated by two distinct enzyme groups, that is, the nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) and the aminoacyl tRNA-dependent cyclodipeptide synthases (CDPSs). Afterwards, different types of tailoring enzymes, such as cytochrome P450s, FAD-dependent oxidoreductases, cyclodipeptide oxidases (CDOs), prenyltransferases (PTs), and methyltransferases (MTs) are involved in installing a number of functional groups to the DKP scaffolds, thus generating various chemical structures. Although CDPSs belong to a newly defined family of enzymes, a large set of CDPSs have been identified. Among them, only several CDPS-associated biosynthetic pathways have been functionally characterized. In recent years, huge amounts of microbial genome sequences have been released in public databases and revealed numerous silent or cryptic gene clusters hiding in their genomes, including those for 2,5-DKPs, indicating great potential for discovery of novel metabolites. Therefore, full exploration of these untapped gene clusters could be a promising way to expand the chemical range of 2,5-DKPs accessible to the medical industry in the future. In the first project, in cooperation with Dr. Huili Yu, eleven CDPSs from Streptomyces strains were selected for investigation based on phylogenetic analysis. Their functions were characterized via heterologous expression in Escherichia coli. The coding sequences of these CDPSs were individually cloned into pET28a (+) vector and overexpressed in soluBL21 host. The fermentation cultures of generated transformants were then analyzed by LC-MS. Combined with structural elucidation of accumulated products by NMR analysis, nine CDPSs for the assembly of tryptophan-containing cyclodipeptides (cWXs) were identified. Therefore, these nine CDP synthases represented new members of the CDPS family that are responsible for cWX biosynthesis. Among them, there is one cyclo-L-Trp-L-Leu synthase, two cyclo-L-Trp-L-Pro synthases, and three cyclo-L-Trp-L-Trp synthases, as well as three unspecific CDPSs producing up to seven products with cyclo-L-Trp-L-Ala or cyclo-L-Trp-L-Tyr as the major product. Under optimized cultivation conditions, total product yields of generated CDPs in the E. coli supernatants reached 46 to 211 mg/L. In recent years, tryptophan-containing DKPs have received increasing attention due to their promising scaffolds for structural modification. Therefore, our study provides a valid experimental basis for further combination of these CDPSs with other tailoring enzymes to generate more interesting chemical entities in the field of synthetic biology. Afterwards, sequence analysis revealed that eight of nine cWX synthase genes identified in the first project are surrounded by a putative cytochrome P450 gene. Among them, two CDPS genes, gutA24309 from Streptomyces monomycini NRRL B-24309 and gutA3589 from Streptomyces varsoviensis NRRL B-3589, are located in the similar gene loci containing four additional genes coding for three modification enzymes, i.e., CDO, cytochrome P450, and MT. Heterologous expression of these two p450-associated cdps-containing gene clusters in Streptomyces coelicolor led to the identification of eight rare and novel C3-guaninyl indole alkaloids, named guanitrypmycins. Expression of different gene combinations and precursor feeding experiments proved the biosynthetic steps of guanitrypmycins. The CDP skeletons, cyclo-L-Trp-L-Phe and cyclo-L-Trp-L-Tyr assembled by the CDPS GutA, will be dehydrogenated merely at the phenylalanyl/tyrosyl side by the CDO Gut(BC) and subsequently connected with a guanine moiety by the P450 GutD. Furthermore, the MT GutE governs the last modification step to transfer a methyl group to N9′ of the guaninyl residue. Moreover, the non-enzymatic epimerization of the enzymatic pathway products via keto–enol tautomerism increases the structural diversity of guanitrypmycins. In addition, biochemical characterization further confirmed that the P450 enzyme GutD functions as the key biocatalyst and catalyzes the unprecedented regio- and stereospecific 3-guaninylation at the indole ring of the tryptophanyl moiety. Therefore, this study highlights the promise of CDPS-containing pathways as sources of novel biosynthetic transformations and natural products. In analogy, two cdps-p450-containing operons were identified in Saccharopolyspora antimicrobica via genome mining. Heterologous expression, biochemical characterization, together with structural elucidation proved that the two P450 enzymes TtpB1 and TtpB2 catalyze distinct regio- and stereospecific dimerizations of cyclo-L-Trp-L-Trp, which are differing from those previously reported in bacteria. TtpB1 represents the first bacterial P450 that catalyzes the stereospecific C3 (sp3)–C3′ (sp3) bond formation between two monomers, both from the opposite side of H-11/H-11′, while TtpB2 is characterized as the first P450 to mainly catalyze the unusual linkage between C3 (sp3) of a hexahydropyrroloindole unit and N1′ of the tryptophanyl moiety of the second monomer from the H-11 side. Thus, our finding significantly increases the repertoire of DKP-tailoring enzymes. Additionally, in comparison with chemical synthesis, this study provides a simple, direct, and efficient approach for enzymatic one-step preparation of structurally complex DKP dimers.

Zusammenfassung:
Naturstoffe aus Cyclodipeptiden (CDPs) mit einem 2,5-Diketopiperazin (DKP) als Grundgerüst sind wichtige Vertreter von Sekundärmetaboliten. Insbesondere Indolalkaloide, die sich von tryptophanhaltigen CDPs ableiten, sind weit verbreitet in Bakterien, Pilzen und Pflanzen. Sie spielen aufgrund ihrer vielseitigen biologischen und pharmakologischen Aktivitäten eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Arzneistoffen. In der Natur wird das DKP von zwei verschiedenen Enzymfamilien gebildet, entweder von nichtribosomalen Peptidsynthetasen oder von aminoacyl-tRNA-abhängigen Cyclodipeptidsynthasen (CDPSs). Anschließend können diverse Enzyme, z.B. FAD-abhängige Oxidoreduktasen, Cytochrom P450, Cyclodipeptidoxidasen (CDOs), Methyltransferasen oder Prenyltransferasen das DKP-Grundgerüst durch Einführung verschiedener funktioneller Gruppen modifizieren. Hierdurch entsteht eine Vielzahl an chemischen Verbindungen. Obwohl CDPSs eine erst kürzlich entdeckte Enzymfamilie darstellen, sind bereits viele unterschiedliche Vertreter gefunden worden. Jedoch wurden nur wenige Biosynthesewege inklusive modifizierender Enzyme vollständig aufgeklärt. Seit einigen Jahren wächst die Anzahl sequenzierter Genome von Mikroorganismen in öffentlichen Datenbanken stetig, sodass etliche nicht aktive oder kryptische Gencluster identifiziert werden konnten. Diese Gencluster weisen großes Potential zur Entdeckung neuer Sekundärmetabolite einschließlich 2,5-DKPs auf. Daher stellt die vollständige Aufklärung solch unerforschter Gencluster einen vielversprechenden Ansatz für die pharmazeutische Industrie dar, um das Spektrum an 2,5-DKPs zu erweitern. In meinem ersten Projekt, in Zusammenarbeit mit Dr. Huili Yu, haben wir auf Basis phylogenetischer Analysen elf CDPSs aus verschiedenen Streptomyces-Stämmen zur genaueren Untersuchung ausgewählt. Ihre Funktion konnte durch heterologe Expression in Escherichia coli aufgeklärt werden. Hierzu wurden die für die CDPSs kodierenden Genabschnitte einzeln in den pET28a (+)-Vektor kloniert und anschließend im E. coli soluBL21 Host überexprimiert. Danach wurden die Transformanten in Flüssigmedium kultiviert, extrahiert und deren Produkte per LC-MS und NMR-Analyse strukturell aufklärt. Dabei haben wir neun CDPSs für die Synthese tryptophanhaltiger Cyclodipeptide (cWXs) identifiziert. Dementsprechend handelt es sich bei diesen neun CDPSs um neue Mitglieder der CDPS-Familie, die die Biosynthese tryptophanhaltiger CDPs katalysieren. Genauer gesagt handelt es sich um eine cyclo-L-Trp-L-Leu-Synthase, zwei cyclo-L-Trp-L-Pro-Synthasen, drei cyclo-L-Trp-L-Trp-Synthasen sowie drei unspezifische CDPSs, die als Hauptprodukt cyclo-L-Trp-L-Ala oder cyclo-L-Trp-L-Phe bilden. Unter optimierten Kultivierungsbedingungen konnten wir Ausbeuten von 46 - 211 mg/L erzielen. In letzter Zeit ist den tryptophanhaltigen DKPs vermehrte Aufmerksamkeit zuteil geworden, da ihr Grundgerüst ein vielversprechender Vorläufer für strukturelle Modifizierungen ist. Unsere Arbeit bietet daher eine valide, experimentelle Basis für die synthetische Biologie, um durch Kombinationen mit anderen nachgeschalteten Enzymen weitere interessante Verbindungen zu generieren. Nach erfolgreichem Abschluss des ersten Projekts konnte ich durch weitergehende Sequenzanalysen der für cWX Synthasen kodierenden Gene bei acht von neun Genen jeweils ein Gen in unmittelbarer Nachbarschaft finden, welches mutmaßlich für Cytochrom P450-Enzyme kodiert. Hierbei habe ich mich auf zwei Gencluster aus Streptomyces monomycini NRRL B-24309 bzw. Streptomyces varsoviensis NRRL B-3589 konzentriert. Die beiden CDPS-Gene gutA24309 bzw. gutA3589 sind von vier weiteren Genen, die für drei Enzyme kodieren, umgeben ̶ nämlich einer Cyclodipeptidoxidase, einem Cytochrom P450 und einer Methyltransferase. Nach heterologer Expression dieser biosynthetischen Gencluster in Streptomyces coelicolor konnte ich acht außergewöhnliche und neue Guanitrypmycine strukturell aufklären, welche an Position C3 des Tryptophanrestes guanyliert sind. Durch unterschiedliche Kombinationen der einzelnen Gene sowie Zufütterungsversuche konnte ich die einzelnen Schritte der Guanitrypmycin-Biosynthese entschlüsseln. Das von der CDPS GutA gebildete CDP wird im ersten Schritt durch die CDO Gut(BC) am Phenylalanin- bzw. am Tyrosinrest oaxidiert. oxidiert. Danach überträgt das P450 GutD ein Guanin auf den Tryptophanrest und anschließend wird der Stickstoff an Position 9′ des Guaninrestes durch die Methyltransferase GutE methyliert. Darüber hinaus wird das Spektrum der Guanitrypmycine durch nicht-enzymatische Epimerisierung in Form einer Keto-Enol-Tautomerie erweitert. Anhand weiterführender biochemischer Untersuchungen konnte die Funktion des Cytochrom P450 GutD als Schlüsselkatalysator dieser bisher beispiellosen, regio- und stereoselektiven 3α-Guanylierung des Tryptophanrestes bestätigt werden. Diese Arbeit unterstreicht, wie aussichtsreich CDPSs beinhaltende Biosynthesewege als Quelle neuer biochemischer Reaktionen und der damit verbundenen Entdeckung unbekannter Naturstoffe sind. In gleicher Herangehensweise habe ich zwei weitere CDPSs in Saccharopolyspora antimicrobica mittels Genomanalyse entdeckt, die mit P450s zusammen lokalisiert sind. Durch heterologe Expression, biochemische Untersuchung und LC-MS und NMR-gestützter Strukturaufklärung konnte ich beweisen, dass die zwei P450s TtpB1 und TtpB2 die regio- und stereospezifische Dimerisierung zweier cyclo-L-Trp-L-Trp katalysieren. Diese Art der Dimerisierung war zuvor nicht in Bakterien bekannt. TtpB1 ist das erste identifizierte P450, welches eine stereospezifische C3 (sp3)–C3′ (sp3) Bindung verknüpft, jeweils gegenüber zu H-11 bzw. H-11′. TtpB2 ist hingegen das erste P450, welches eine ungewöhnliche Bindung zwischen dem C3 (sp3) der Hexahydro-Pyrroloindoleinheit und dem N1′ des Tryptophanrestes einfügt. Hiermit konnte ich das Repertoire an DKP-modifizierenden Enzymen signifikant erweitern und darüber hinaus einen einfachen, direkten und effizienten Weg zur enzymatisch kontrollierten Synthese für synthetisch schwer zugängliche DKP-Dimere aufzeigen.


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