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Titel:Functional reprogramming of Candida glabrata epithelial adhesins by exchange of variable structural motifs
Autor:Hoffmann, Daniel
Weitere Beteiligte: Mösch, Hans-Ulrich (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2020
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2021/0063
DOI: https://doi.org/10.17192/z2021.0063
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2021-00639
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Publikationsdatum:2021-02-15
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Struktur, Adhäsion, Epitheliale Adhäsine, Candida, biochemistry, Biochemie, yeast, Adhäsin, adhesion, Zellwand, Proteine ,Hefeartige Pilze, Adhäsine, cell wall, adhesin, Zellwand, Galactose, Torulopsis glabrata, Naturwissenschaften

Summary:
The yeast Candida glabrata is part of the human microbiome and usually employs a commensal lifestyle, but this fungus is also able to act as an opportunistic pathogen, causing localized as well as severe systemic infections. For host invasion and dissemination, C. glabrata disposes of a large number of cell wall attached proteins, the most prominent of which are the epithelial adhesins (Epas). The Epa family encompasses more than 20 members, which act as lectins. All Epa paralogs share the common tripartite architecture of fungal adhesins, composed of an N-terminal A domain (adhesion domain), a central B domain consisting of a variable number of serine- and threonine-rich repeats, and a C-terminal region carrying a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor for attachment to the cell wall. The lectin function of Epa adhesins is conferred by a combination of conserved and variable structural elements within their A domains. Together, these elements form an inner and outer binding pocket and are thought to control ligand binding affinity and specificity. In this work, variable structural elements of several Epa paralogs were functionally characterized using structure-based mutational analysis, to precisely elucidate their role in conferring host cell adhesion and ligand binding specificity. For this purpose, an array of chimeric EpaA variants carrying directed exchanges of highly variable regions in the inner and the outer binding pocket were constructed and functionally characterized. In vivo adhesion assays with human epithelial cells revealed that both of these structural elements are involved in host cell binding. Specifically, exchanges within the inner binding pocket resulted in a lower binding strength. In contrast, the exchange of elongated loops in the outer binding pocket for shorter variants showed a significant increase in host cell adhesion, whereas chimeras carrying longer instead of shorter loops exhibited reduced adhesion. Chimeric EpaA variants were further characterized by glycan array analysis and fluorescence titration spectroscopy. These measurements demonstrated that the ligand binding specificity of EpaA domains can in principal be reprogrammed by exchange of structural elements in the inner binding pocket, with albeit limited predictability. In contrast, exchanges of outer binding pocket elements generally did not affect ligand binding patterns. For further structural characterization of elongated loops in the outer binding pocket, soaking experiments were performed using protein crystals and complex glycan structures. Since this approach did not yield structural data, the flexibility of long loops was analyzed by molecular dynamic simulations, in order to test a putative lid functionality. These simulations showed that in the absence of glycan ligands, the elongated loop can principally adopt a stable conformation, but does not cover the binding pocket. In the presence of a tetrameric glycan, however, the reducing end of the ligand was stabilized by direct contact with the loop, indicating a crucial function of this variable structural element in binding complex glycan structures. In a further part of this thesis, the function of variable amino acid residues within the inner binding pocket was investigated which have been postulated to confer specific binding of sulfated glycans. To test this hypothesis, corresponding residues were functionally characterized by mutational analysis in combination with in vivo adhesion tests to human epithelial cells and in vitro ligand binding studies. Interestingly, no correlation was detected between mutated positions and specific sulfoglycan binding. However, docking simulations with sulfated disaccharide ligands suggest that other steric effects control the precise fitting of spatially demanding sulfate groups into the binding pockets of EpaA domains. In summary, results obtained in this work support the view, that variation of several structural elements in the inner and outer ligand binding pocket of Epa adhesins is a main driver of their functional diversification and evolution.

Zusammenfassung:
Der Hefepilz Candida glabrata ist Teil des menschlichen Mikrobioms und zeigt üblicherweise eine kommensale Lebensweise. Dieser Pilz ist aber auch in der Lage, als opportunistischer Erreger zu wirken und lokale sowie schwere systemische Infektionen zu verursachen. Für das Eindringen in den Wirt und die weitere Ausbreitung verfügt C. glabrata über eine große Anzahl zellwandgebundener Proteine, von denen die epithelialen Adhäsine (Epas) die bekanntesten sind. Die Epa-Familie umfasst mehr als 20 Mitglieder, die als Lektine wirken. Alle Epa-Paraloge besitzen die dreiteilige Architektur pilzlicher Adhäsine mit einer N-terminalen A-Domäne (Adhäsionsdomäne) und einer zentralen B-Domäne, die aus einer variablen Anzahl von serin- und threonin-reichen Wiederholungen besteht. Die C-terminale Region trägt einen Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker zur Befestigung an der Zellwand. Die Lektinfunktion von Epa-Adhäsinen wird durch eine Kombination von konservierten und variablen Strukturelementen innerhalb ihrer A-Domäne bestimmt. Zusammen bilden diese Elemente eine innere und äußere Bindetasche und kontrollieren voraussichtlich die Affinität und Spezifität der Ligandenbindung. In dieser Arbeit wurden variable Strukturelemente mehrerer Epa-Paraloge mit Hilfe einer strukturbasierten Mutationsanalyse funktionell charakterisiert, um ihre Rolle bei der Vermittlung der Wirtszelladhäsion und der Spezifität der Ligandenbindung aufzuklären. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe chimärer EpaA-Varianten konstruiert und funktionell charakterisiert, in denen hochvariable Regionen der inneren und äußeren Bindetasche ausgetauscht wurden. In-vivo-Adhäsionsassays mit menschlichen Epithelzellen zeigten, dass diese beiden Strukturelemente an der Wirtszellbindung beteiligt sind. Insbesondere führten Austausche innerhalb der inneren Bindetasche zu einer verringerten Bindungsstärke. Im Gegensatz dazu zeigte der Austausch verlängerter Schleifen in der äußeren Bindetasche gegen kürzere Varianten eine signifikante Zunahme der Wirtszelladhäsion, während Chimären, die längere statt einer kürzeren Schleife trugen, eine geringere Adhäsion aufwiesen. Die chimären EpaA-Varianten wurden anschließend durch Glykanarray-Analyse und Fluoreszenztitrationsspektroskopie charakterisiert. Diese Messungen zeigten, dass die Ligandenbindungsspezifität der EpaA-Domänen prinzipiell durch Austausch von Strukturelementen in der inneren Bindetasche umprogrammiert werden kann, allerdings mit begrenzter Vorhersagbarkeit. Im Gegensatz dazu hatte der Austausch von Elementen in der äußeren Bindetasche im Allgemeinen keinen Einfluss auf die Ligandenbindungsmuster. Zur weiteren strukturellen Charakterisierung der verlängerten Schleifen in der äußeren Bindetasche wurden Soaking-Versuche mit Proteinkristallen und komplexen Glykanen durchgeführt. Da dieser Ansatz keine strukturellen Daten lieferte, wurde die Flexibilität der verlängerten Schleifen durch Molekulardynamiksimulationen analysiert, um eine vermutete Deckelfunktionalität zu testen. Diese Simulationen zeigen, dass in Abwesenheit von Glykanliganden die verlängerte Schleife prinzipiell eine stabile Konformation annehmen kann, aber die Bindetasche nicht bedeckt. In Gegenwart eines tetrameren Glykans wurde jedoch das reduzierende Ende des Liganden durch direkten Kontakt mit der Schleife stabilisiert, was auf eine wichtige Funktion dieses variablen Strukturelements bei der Bindung komplexer Glykanstrukturen hinweist. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde die Funktion variabler Aminosäurereste innerhalb der inneren Bindetasche untersucht, für die postuliert wurde, dass sie für eine spezifische Bindung von sulfatierten Glykanen verantwortlich sind. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden entsprechende Auminosäuren durch Mutationsanalyse in Kombination mit in-vivo-Adhäsionstests an humanen Epithelzellen und in-vitro-Ligandenbindungsstudien funktionell charakterisiert. Interessanterweise wurde keine Korrelation zwischen den mutierten Positionen und spezifischer Sulfoglykanbindung festgestellt. Bindungssimulationen mit sulfatierten Disaccharidliganden deuten jedoch darauf hin, dass andere sterische Effekte die spezifische Bindung von räumlich anspruchsvollen Sulfatgruppen in EpaA-Domänen kontrollieren. Zusammenfassend unterstützen die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse die Annahme, dass die Variation verschiedener Strukturelemente in der inneren und äußeren Ligandenbindetasche der EpaA-Adhäsine ein Hauptfaktor für ihre funktionelle Diversifizierung und Evolution ist.


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