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Titel:Molekulare Identifizierung und funktionelle Charakterisierung der K+-Kanal-Ausstattung auditorischer Haarsinneszellen
Autor:Dierich, Marlen
Weitere Beteiligte: Leitner, Michael (Dr.)
Veröffentlicht:2020
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2021/0013
DOI: https://doi.org/10.17192/z2021.0013
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2021-00138
DDC:610 Medizin
Publikationsdatum:2021-01-21
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Alzheimer, BACE1, Kaliumkanäle, Kv11.1, Kv7,4, Neuregulin-1, Haarsinneszellen, Kv12.1, Kv1.8

Zusammenfassung:
Hintergrund: Die präzise Verarbeitung von auditiven Reizen wird durch äußere (ÄHZ) und innere Haarsinneszellen (IHZ) im Corti´schen Organ gewährleistet. Da die physiologischen Aufgaben (kochleäre Verstärkung und synaptische Übertragung) dieser Zellen vom Rezeptorpotential angetrieben werden, sind Form und Amplitude dieser Potentialänderungen essentiell für die Funktion der Sinneszellen. Die Charakteristika der Rezeptorpotentiale hängen dabei von der Aktivität der apikalen mechano-elektrischen Transduktionskanäle und von basolateralen K+-Leitfähigkeiten ab. Diese Leitfähigkeiten wurden aufgrund ihrer biophysikalischen Eigenschaften als IK,f, IK,n und IK,s klassifiziert. Die Ionenkanäle und deren Interaktionspartner, die diese K+-Leitfähigkeiten hervorbringen, sind weitestgehend unbekannt. Ziele der Arbeit: Die Ziele dieser Doktorarbeit waren es, (I.) die Relevanz eines möglichen Interaktionspartners (das Enzym β-Sekretase 1; BACE1) der K+-Kanäle in ÄHZ zu untersuchen, und (II.) die K+-Kanaluntereinheiten, welche die IK,s Komponente in IHZ von Mäusen ausmachen, zu entschlüsseln, sowie deren physiologische Aufgaben anhand von Computermodellen zu bestimmen. Ergebnisse zu BACE1: Ich konnte zeigen, dass der signifikante Hörverlust der BACE1-/- Mäuse durch Desorganisation der synaptischen Verbindungen zwischen IHZ und auditorischen Nervenfasern und durch eine stark verringerte Myelinisierung dieser Nervenfasern hervorgerufen wird. Dabei ist BACE1 für die Entwicklung der kochleären Nervenfasern, nicht jedoch für die Aufrechterhaltung der Myelinisierung von Bedeutung. Außerdem konnte ich Neuregulin-1 als BACE1-Substrat identifizieren, das die Organisation der Nervenfasern in der Cochlea vermittelt. BACE1 ist also entgegen unserer Ausgangshypothese kein Interaktionspartner von K+-Kanälen in Haarsinneszellen, jedoch unabkömmlich für sensitives Hören. Da die Inhibition von BACE1 ein populärer Ansatz zur Therapie der Alzheimer-Krankheit ist, war es wichtig zu prüfen, ob entsprechende Medikamente Auswirkungen auf die Hörleistung haben. Die Behandlung von Mäusen mit dem BACE1-Inhibitor NB-360 beeinträchtigte jedoch nicht das Hörvermögen der Tiere. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Hörverlust keine Nebenwirkung der Therapie der Alzheimer-Krankheit darstellt. Ergebnisse zur K+-Kanalausstattung der Haarsinneszellen: In einem Hypothesen-basierten Kandidatenansatz ist es mir gelungen, die K+-Kanalausstattung von IHZ zu entschlüsseln. Dafür habe ich aus publizierten Einzelzell-Transkriptom-Analysen von IHZ Kandidatenkanäle extrahiert und deren Expression in der Cochlea mittels molekularbiologischen und immunhistochemischen Techniken bestätigt. Mittels elektrophysiologischer Methoden konnte ich dann überprüfen, ob diese Kanäle in den IHZ aktiv sind. Für den funktionellen Nachweis konnte ich zum einen auf etablierte Protokolle zurückgreifen, andere Kandidatenkanäle musste ich erst im Expressionssystem eingehend charakterisieren und selbst geeignete Messprotokolle und ein pharmakologisches Profil zum Nachweis in nativem Gewebe entwickeln. Diese Untersuchungen zeigten, dass sich trotz enger phylogenetischer Verwandtschaft und darauf aufbauenden Ähnlichkeiten in der Gesamtarchitektur, die pharmakologischen Eigenschaften von K+-Kanälen doch signifikant unterscheiden können. Aufbauend auf den Arbeiten im Expressionssystem konnte ich dann zeigen, dass Kv1.8-, Kv11.1- und Kv12.1-Kanäle in IHZ aktiv sind. Somit konnte ich Kv11.1-Kanälen erstmals eine Rolle im sensorischen System, und Kv1.8- und Kv12.1-Kanälen überhaupt erstmalig eine physiologische Bedeutung zuweisen. Die Relevanz dieser außergewöhnlichen Ausstattung aus fünf K+-Kanaluntereinheiten in IHZ (Kv1.8-, Kv7.4-, Kv11.1-, Kv12.1- und BKCa-Kanäle) wurde dann anhand von Computermodellen eingehend untersucht. Diese Simulationen zeigten, dass alle Kanäle gemeinsam die Präzision der Schallverarbeitung in IHZ optimieren und die Verarbeitung komplexer Schallereignisse und somit sensitives Hören überhaupt erst ermöglichen, während IHZ mit vereinfachter Kanalzusammensetzung in der Verarbeitung von Schallreizen eingeschränkt sind.

Summary:
Background: The precise processing of auditory stimuli is ensured by outer (OHC) and inner hair cells (IHC) in the organ of Corti. Since the physiological tasks (cochlear amplification and synaptic transmission) of these cells are driven by receptor potentials, the shape and the amplitude of these potential changes are essential for the function of the sensory cells. The characteristics of these receptor potentials depend on the activity of the apical mechano-electrical transduction channels and on basolateral (voltage-dependent) K+ conductances, which together define the biophysical membrane properties of the sensory cells. Due to their biophysical properties, the basolateral K+ currents were previously classified as IK,f, IK,n and IK,s. The underlying ion channels and their modulatory interaction partners are largely unknown. Aims of the thesis: The goals of this doctoral thesis were (I.) to investigate the role of a potential interaction partner (the enzyme β-secretase 1; BACE1) for K+ channel function in hair cells, and (II.) to unravel the channel subunits that make up the K+ channel repertoire in IHCs, as well as to elucidate the physiological relevance of these K+ channels by using in-silico simulations. Results on BACE1: I found that BACE1-/- mice exhibit significant hearing loss compared to wild-type mice, which is caused by disorganization of the synaptic connections between the IHC and the auditory nerve fibers and greatly reduced myelination of these nerve fibers. Noteworthy, BACE1 is important for the development of the cochlear nerve fibers, but not for the maintenance of their myelination in adulthood. I also identified Neuregulin-1 as the BACE1 substrate in the cochlea that is pivotal for normal organization and myelination of the cochlear nerve fibers. Contrary to our initial hypothesis, BACE1 thus is not an interaction partner of K+ channels in sensory hair cells. However, my results showed for the first time that BACE1 is indispensable for sensitive hearing. Because inhibiting BACE1 is considered a promising approach to treat Alzheimer's disease, it was important to determine whether such medication could affect hearing sensitivity. We did not detect any hearing impairment or abnormal changes in the cochlea of mice treated with the well-known BACE1 inhibitor NB-360. These results suggest that hearing loss may not be a side-effect of Alzheimer's disease therapy with BACE1 inhibitors. Results on the K+ channel repertoire of auditory hair cells: In a hypothesis-driven candidate approach, I succeeded in deciphering the K+ channel repertoire of IHCs. First, I extracted candidate channels from published single cell transcriptome analyses of IHCs. Then I confirmed expression of these channels in the cochlea using molecular biological and immunohistochemical methods. I employed electrophysiological techniques to elucidate whether these candidate channels are active in IHCs. To develop an approach towards identification of channel subtypes by their biophysical properties, I established protocols in heterologous expression system to characterize the candidate channels in detail. Thus, I identified unique properties and suitable measurement protocols for subsequent detection in native tissue. Surprisingly, these studies showed that despite close phylogenetic relationship and similarities in the overall architecture, the pharmacological properties of K+ channels can differ significantly. Based on the work in the expression system, I was able to show that Kv1.8, Kv11.1 and Kv12.1 channels are active in IHCs. Hence, for the first time I could assign a role in a sensory system to Kv11.1 channels, and my results constitute the first demonstration of relevance of Kv1.8 and Kv12.1. We then untangled the physiological importance of this extraordinary repertoire of five K+ channel subunits (Kv1.8, Kv7.4, Kv11.1, Kv12.1 and BKCa channels) in detail using in-silico simulations. These models showed that all channels together synergistically optimize the precision of sound processing in IHCs, while IHCs with fewer channel populations are limited in the processing of sound stimuli adequately. The channel repertoire thus represents an evolutionary adaptation, that enables the processing of complex sounds and sensitive hearing.


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