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Titel:Atherosclerosis: The Role of Growth-Differentiation-Factor-15 (GDF-15) in human THP-1 Macrophages Autophagy and Lipid homeostasis
Autor:Ackermann, Kathrin
Weitere Beteiligte: Kinscherf, Ralf (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2020
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2020/0349
DOI: https://doi.org/10.17192/z2020.0349
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2020-03492
DDC: Medizin
Titel(trans.):Arteriosklerose: Die Rolle des Wachstums-Differenzierungsfaktor-15 (GDF-15) in humanen THP-1 Makrophagen Autophagie und Lipidhomöostase
Publikationsdatum:2020-09-21
Lizenz:https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Makrophagen, GDF-15, Arteriosklerose, GDF-15, Autophagy, Lipid homeostasis, Macrophages, Autophagie, Lipidhomöostase, Atherosclerosis

Summary:
Cardiovascular diseases are the leading cause of death, representing more than 30% of all global deaths. Risk factors for developing atherosclerotic alterations are hypertension, diabetes, obesity, nicotine or alcohol abuse, which are widespread among industrial nations. Atherosclerotic alterations concern human arteries, where infiltration of modified lipids triggers an immune response, initiating the transmigration of monocytic cells and smooth muscle cells to remove this subendothelial accumulated lipids. In this context, autophagic processes were found highly active in atherosclerotic plaques, especially in lesional macrophages (MΦ). Supporting the MΦ reverse cholesterol transport, autophagy aids to resolve the subendothelial lipid accumulation, promoting plaque reduction and plaque stability. Furthermore, the cytokine Growth-Differentiation-Factor-15 (GDF-15) was found strongly expressed in lesional MΦ, where it is implicated in reverse cholesterol transport as well. These findings suggest a potential link between autophagy and GDF-15 in MΦ lipid homeostasis. This possible implication of GDF-15 in macrophages autophagy and lipid homeostasis was investigated in the present work. Therefore, we diminished or increased GDF-15 protein levels in human THP-1 MΦ, using small interfering RNAs and recombinant GDF-15 protein. Exposing THP-1 MΦ to oxLDL was used to induce foam cell formation. Subsequently, intracellular lipid accumulation and cholesterol levels, autophagy-relevant proteins, as well as autophagic and lysosomal activity were investigated. Aiming to investigate the basal autophagy in macrophages, we altered the GDF-15 protein level without exposing THP-1 MΦ to oxLDL. Diminishing the GDF-15 protein level in THP-1 MΦ led to decreased intracellular lipid accumulations, whereas cholesterol levels remained unaltered. Furthermore, the ATG5 and p62 protein levels decreased, as well as the ATG12 / ATG5-complex levels. Additionally, the p62 accumulation and the autophagy activity were diminished. Since ATG5 and ATG12 are mandatory for the autophagosome formation and p62 accumulation represents autophagic vesicles, these observations indicated to a diminished autophagosome formation, which explained the observed reduction in the autophagy activity. An increased GDF-15 protein level did not influence ATG5 and p62 protein levels or the ATG12 / ATG5-complex. However, it enhanced the p62 and Lamp-1 accumulations and increased the autophagy activity, whereas the lysosome activity remained unaltered. Thus, we concluded that GDF-15 possibly stabilizes the ATG5 protein level or facilitates the ATG12 / ATG5-complex assembly, leading to enhanced build-up in autophagic vesicles and thereby increasing the autophagy activity. To test, whether GDF-15 may operate further upstream in the autophagy signaling pathway, we investigated the Beclin-1 protein level and phosphorylation status of mTOR. Amplified GDF-15 protein levels did not influence Beclin-1 or phosphorylation status of mTOR, which confirmed our conclusion about the impact of GDF-15 on MΦ autophagy being linked to ATG5 protein and/or ATG12 / ATG5-complex. In exposing THP-1 MΦ to oxLDL, we induced foam cell formation. Upon oxLDL-exposure, THP-1 MΦ showed increased lipid accumulation, whereas the cholesterol levels remained unaltered. The p62 and Lamp-1 accumulation were increased, whereas the autophagic and lysosomal activities were diminished. These results were in line with already published data, where oxLDL was reported to induce lipid accumulation and to lead to lysosome expansion and to disturb lysosomal activity. Likewise, our observations of impaired autophagy activity and accumulation of autophagic vesicles have already been described. In proceeding to investigate GDF-15-depending autophagy in foam cells, we exposed THP-1 MΦ with altered GDF-15 protein levels to oxLDL. The combination of an enhanced GDF-15 protein level in THP-1 MΦ and exposure to oxLDL increased the ATG5 and p62 protein levels and the ATG12 / ATG5-complex. Furthermore, increased GDF-15 protein levels in foam cells amplified the p62 and Lamp-1 accumulation, compared to oxLDL-exposure alone. Whereas an enhanced or diminished GDF-15 protein level in combination with oxLDL-exposure had no additional influence on the autophagy and lysosome activity, which remained repressed just like after exposure to oxLDL alone. Conclusively, we found that increased GDF-15 protein levels aggravated the oxLDL-induced accumulation of autophagic vesicles, whereas vice versa decreased GDF-15 protein levels diminished the oxLDl-induced accumulation of autophagic vesicles. This work is the first one to reveal the crucial role of GDF-15 on MΦ autophagy: GDF-15 acts protective during basal autophagy, whereas during excess lipid stimuli, this GDF-15 influence on autophagosome formation aggravates the lipid-induced accumulation of autophagic vesicles. These observations identify GDF-15 as an important regulator in macrophage autophagy and lipid homeostasis, revealing its potential for new therapeutic strategies e.g. in atherosclerosis and cardiovascular diseases or stroke.

Zusammenfassung:
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Todesursache mit mehr als 30% aller Todesfälle weltweit. Risikofaktoren für die Entwicklung arteriosklerotischer Veränderungen sind Bluthochdruck, Diabetes, Fettleibigkeit, Nikotin- oder Alkoholmissbrauch, welche in den Industrie-Nationen weit verbreitet sind. Arteriosklerotische Veränderungen betreffen menschliche Arterien, bei denen die Infiltration modifizierter Lipide eine Immunantwort auslöst. Diese Immunantwort führt zur Transmigration monozytärer Zellen und glatter Muskelzellen, um diese subendothelialen Lipidansammlungen zu entfernen. In diesem Zusammenhang wurde eine erhöhte Autophagie-Aktivität in arteriosklerotischen Plaques, insbesondere in Plaque-Makrophagen (MΦ) nachgewiesen. Diese erhöhte Autophagie-Aktivität trägt unter anderem zum Export von Cholesterin und somit zur Auflösung der subendothelialen Lipidansammlungen bei. Dadurch fördert Autophagie die Plaque-Reduktion und die Plaque-Stabilität. Darüber hinaus ist das Zytokin Wachstums-Differenzierungs-Faktor-15 (GDF-15) in Plaque- MΦ stark exprimiert, wo es am Export von Cholesterin beteiligt ist. Diese Beobachtungen deuten auf eine mögliche Verbindung zwischen Autophagie und GDF-15 in der Lipidhomöostase der MΦ hin, welche in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde. Dazu wurde das GDF-15-Proteinlevel in humanen THP-1-Makrophagen vermindert oder erhöht. Erreicht wurde dies durch die Verwendung von small interfering RNAs oder rekombinantem GDF-15-Protein. Die Bildung von Schaumzellen wurde dabei durch Stimulation der THP-1- MΦ mit oxLDL induzieren. Anschließend wurden die intrazelluläre Lipidakkumulation und der Cholesterinspiegel, Autophagie-relevante Proteine sowie die Autophagie- und Lysosomen-Aktivität untersucht. Zur Untersuchung der basalen Autophagie in MΦ wurde das GDF-15-Proteinlevel modifiziert, ohne zunächst die Schaumzellbildung durch oxLDL zu induzieren. Die Verminderung des GDF-15-Proteinlevels führte zu einer verminderten intrazellulären Lipidanreicherung, während der Cholesterinspiegel unverändert blieb. Darüber hinaus erniedrigte sich das ATG5-Proteinlevel, das ATG12 / ATG5-Komplex-Level, sowie das p62-Proteinlevel, die p62-Akkumulationen und eine Verminderung in der Autophagie-Aktivität waren messbar. Da ATG5 und ATG12 essentiell für die Autophagosomenbildung sind und p62-Akkumulationen die Bildung von Autophagie-Vesikeln widerspiegeln, deuteten diese Beobachtungen auf eine verminderte Autophagosomenbildung hin, was wiederum die gemessene Verminderung in der Autophagie-Aktivität erklärt. Eine Erhöhung des GDF-15-Proteinlevels in THP-1- MΦ hatte keinen Einfluss auf das ATG5- und p62-Proteinlevel, oder die Bildung des ATG12 / ATG5-Komplex. Allerdings verstärkte es die p62- und Lamp-1-Akkumulationen und erhöhte die Autophagie-Aktivität, während die Lysosomen-Aktivität unverändert blieb. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass GDF-15 möglicherweise das ATG5-Proteinlevel stabilisiert oder die Bildung des ATG12 / ATG5-Komplex erleichtert, was die verstärkte Bildung und Anreicherung von Autophagie-Vesikeln, sowie die erhöhte Autophagie-Aktivität erklären würde. Ein erhöhtes GDF-15-Proteinlevel zeigte keine Auswirkungen auf das Beclin-1 Proteinlevel oder den Phosphorylierungsstatus von mTOR. Somit festigte sich die Schlussfolgerung bezüglich des Einflusses von GDF-15 auf die Stabilisierung von ATG5 und/oder die Komplexbildung von ATG12 / ATG5. Durch die oxLDL-Stimulation wurde die Schaumzellbildung in THP-1 MΦ induziert. Nach oxLDL-Stimulation zeigten THP-1 MΦ eine erhöhte Lipidakkumulation, während die Cholesterinwerte unverändert blieben. Die p62- und Lamp-1-Akkumulation nahm zu, während die Autophagie- und Lysosomen-Aktivität abnahm. Diese Ergebnisse standen im Einklang mit bereits publizierten Daten, in denen oxLDL eine Lipidakkumulation induzierte und zu einer Ausdehnung der Lysosomen führte, sowie die lysosomale Aktivität störte. Ebenso ist die hier nachgewiesene, gestörte Autophagie-Aktivität und die Akkumulation von Autophagie-Vesikeln bereits publiziert. Zur Untersuchung der GDF-15-abhängigen Autophagie in Schaumzellen, wurden THP-1-MΦ mit modifiziertem GDF-15-Proteinlevel ebenfalls oxLDL-exponiert. Die Kombination eines erhöhten GDF-15 Proteinlevels führte in oxLDL-exponierten THP-1 MΦ zu einer Erhöhung des ATG5- und p62-Proteinlevels, sowie einer vermehrten ATG12 / ATG5-Komplex-Bildung. Darüber hinaus führte ein erhöhtes GDF-15 Proteinlevel in Kombination mit oxLDL zu vermehrten p62- und Lamp-1-Akkumulationen, verglichen mit alleiniger oxLDL-Stimulation. Eine Erhöhung oder Verminderung des GDF-15 Proteinlevels hatte keinen weiteren Einfluss auf die Autophagie- und die Lysosomen-Aktivität, welche beide weiterhin vermindert blieben, wie bereits nach alleiniger oxLDL-Stimulation feststellbar. Zusammenfassend konnten wir nachweisen, dass ein erhöhtes GDF-15 Proteinlevel die oxLDL-induzierte Akkumulation von Autophagie-Vesikeln verschlimmert, während umgekehrt ein erniedrigtes GDF-15 Proteinlevel die oxLDL-verursachte Akkumulation von Autophagie-Vesikeln erniedrigt. Somit wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals die entscheidende regulatorische Rolle von GDF-15 in der MΦ-Autophagie nachgewiesen. Durch Beeinflussung der Autophagosomen-Bildung wirkt GDF-15 während der basalen Autophagie schützend. Bei überschüssigem Lipid-Stimulus verschärft GDF-15 jedoch die lipidinduzierte Akkumulation von Autophagie-Vesikeln. Diese Erkenntnisse lassen sich möglicherweise für neue therapeutische Strategien z.B. bei Arteriosklerose, kardiovaskulären Erkrankungen oder Schlaganfällen nutzen.


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