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Titel:Charakterisierung des trans-Aconitat-Metabolismus und dessen Regulierung in Ustilago maydis
Autor:Büttner, Linda
Weitere Beteiligte: Bölker, Michael (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2020
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2020/0232
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2020-02328
DOI: https://doi.org/10.17192/z2020.0232
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Characterization of the trans-aconitate metabolism and its regulation in Ustilago maydis
Publikationsdatum:2020-07-27
Lizenz:https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Dokument

Schlagwörter:
Glucose reprimiert, Dünnschichtchromatographie, HPLC, chimeric transcription factor, Aconitat-Hydratase, ungewöhnliche Kohlenstoffquelle, aconitate-delta-is, Sekundärstoffwechsel, toxisches Substrat, chimärer Transkriptionsfaktor, Adi2 gene cluster, Import, Sekundärmetabo, toxic substrate, Antifraßstoff von Pflanzen, Ustilaginsäure, Glucose repressed, Glykolipide, Zn(II)2-Cys6 Trans, antifeedant by plants, Ustilago zeae, unusual carbon source

Zusammenfassung:
Die ungesättigte Carbonsäure trans-Aconitat ist ein Isomer von cis-Aconitat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, welches durch die Aconitase synthetisiert wird. Es ist bekannt, dass trans-Aconitat von zuckerhaltigen Pflanzen und auch von Bakterien als Schadstoff produziert wird, da es als Inhibitor der Aconitase und der Fumarase wirkt und daher toxisch sein kann. In Ustilago maydis wurde im Verlauf dieser Arbeit ein Gencluster charakterisiert, der es dem Pilz erlaubt, trans-Aconitat als alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen und darüber hinaus der Toxizität dieses Metaboliten entgegenwirkt. In diesem Gencluster befinden sich vier gemeinsam regulierte Gene. Zwei codieren für die Transporter, die sich in der Plasmamembran bzw. in den Mitochondrien befinden. Die Charakterisierung von Mutanten und HPLC-Messungen des trans-Aconitat Abbaus zeigten, dass der in der Zellmembran befindliche Transporter Aip1 notwendig ist, um trans-Aconitat in die Zellen einzuschleusen. Der mitochondriale Transporter Mtt2 ist ebenfalls notwendig für das Wachstum von Zellen auf trans-Aconitat als alleiniger Kohlenstoffquelle. Zudem sind in dem Cluster eine Aconitat-delta-Isomerase Adi2 und ein Transkriptionsfaktor Ram1 codiert. Die Isomerase Adi2 war namensgebend für den Cluster, da sie sehr ähnlich zu der Isomerase Adi1 ist, die für die Itaconsäurebiosynthese in U. maydis notwendig ist (Geiser et al., 2016). Adi2 konnte aufgrund seiner Ähnlichkeit zu Adi1 identifiziert werden (Przybilla, 2014). Genetische Analysen wiederum in Kombination mit HPLC-Messungen zeigten, dass Adi2 für die Isomerisierung von trans-Aconitat in cis-Aconitat verwendet wird und außerdem notwendig ist, um toxisches trans-Aconitat aus dem Cytosol zu entfernen. Der Transkriptionsfaktor Ram1 gehört zur Familie der Zn(II)2-Cys6 Transkriptionsfaktoren und ist für die Regulation des Adi2-Genclusters verantwortlich. Diese Transkriptionsfaktor-Familie ist in der Lage, mithilfe eines binuklearen Zink-Clusters konservierte DNA-Motive zu binden. Für die Bindung von Ram1 in der Promotorregion der einzelnen Clustergene konnte ein DNA-Motiv postuliert werden. Die Aktivierungsdomäne von Ram1 wird durch die Anwesenheit von trans-Aconitat stimuliert, wodurch Ram1 nur dann in der Lage ist, die Transkription der Clustergene einzuleiten, wenn trans-Aconitat vorhanden ist. Der genaue Mechanismus der Wirkung von trans-Aconitat auf den Transkriptionsfaktor konnte noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Experimente mit chimeren Transkriptionsfaktoren legen jedoch nahe, dass vermutlich nicht direkt die Bindung an die DNA durch trans-Aconitat beeinflusst wird. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Glucose unabhängig von Ram1 die Expression der Gene des Adi2-Genclusters inhibieren kann.

Summary:
The unsaturated carboxylic acid trans-aconitate is an isomer of cis-aconitate, an intermediate of the citric acid cycle, which is synthesized by the aconitase. It is known that trans-aconitate is produced by plants containing sugar and also by bacteria as a toxic substance, since it acts as an inhibitor of aconitase and fumarase. In Ustilago maydis a gene cluster was characterized in the course of this work which allows the fungus to use trans-aconitate as the sole carbon source and also counteracts the toxicity of this metabolite. This gene cluster contains four genes that are regulated together. Two code for transporters that are located in the plasma membrane and in the mitochondria. The characterization of mutants and HPLC measurements of the trans-aconitate degradation showed that the transporter Aip1 located in the cell membrane is necessary to import trans-aconitate into the cells. The mitochondrial transporter Mtt2 is also necessary for the growth of the cells on trans-aconitate as the sole carbon source. In addition an aconitate-delta-isomerase Adi2 and a transcription factor Ram1 are encoded in the cluster. The isomerase Adi2 gave the cluster its name because it is very similar to the isomerase Adi1, which is necessary for itaconic acid biosynthesis in U. maydis (Geiser et al., 2016). Adi2 was identified due to its similarity to Adi1 (Przybilla, 2014). Genetic analyzes in combination with HPLC measurements showed that Adi2 is used for the isomerization of trans-aconitate to cis-aconitate and is also necessary to remove toxic trans-aconitate from the cytosol. The transcription factor Ram1 belongs to the family of Zn(II)2-Cys6 transcription factors and is responsible for the regulation of the Adi2 gene cluster. This family of transcription factors is able to bind conserved DNA motifs using a binuclear zinc cluster. A DNA motif was postulated for the binding of Ram1 to the promoter region of the individual cluster genes. The activation domain of Ram1 is stimulated by the presence of trans-aconitate, which means that Ram1 is only able to initiate transcription of the cluster genes when trans-aconitate is present. The exact mechanism of the effect of trans-aconitate on the transcription factor has not been fully elucidated yet. However, experiments with chimeric transcription factors suggest that binding to DNA is probably not directly influenced by trans-aconitate. In addition, it was shown that glucose can inhibit the expression of the genes of the Adi2 gene cluster independently of Ram1.


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