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Titel: Synthese von D-Phe/D-DiPhe-Pro-basierenden Liganden und deren biophysikalischen Charakterisierung zur Selektivitätsstudie von Thrombin und Trypsin sowie ein synthetischer Beitrag zur Darstellung von Inhibitoren der Aldose-Reduktase und Carboanhydrase II
Autor: Ngo, Trong Khang
Weitere Beteiligte: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2020
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2020/0081
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2020-00816
DOI: https://doi.org/10.17192/z2020.0081
DDC: Chemie
Titel(trans.): Synthesis of D-Phe/D-DiPhe-Pro based ligands and their biophysical characterization for the selectivity study of thrombin and trypsin as well as a synthetic contribution of aldose reductase and carbonic anhydrase II inhibitors
Publikationsdatum: 2020-10-14
Lizenz: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Dokument

Schlagwörter:
Synthese, Trypsin, Aminopyridin, Protein-Ligand-Wechselwirkungen, Selektivität, Bindung, Thrombin, Protonierungszustände, Proteinkristallographie, ITC

Zusammenfassung:
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit (Kapitel 1-7) wird ein Syntheseprojekt einer kongenerischen Serie von D-Phe/D-DiPhe-Pro-basierenden Inhibitoren für Thrombin und Trypsin sowie deren biophysikalischen Charakterisierung vorgestellt. Beide Proteine sind strukturell hochgradig verwandte Serinproteasen, die Unterschiede in ihrer Substraterkennung aufweisen. Thrombin ist Arg-spezifisch, während Trypsin Peptidketten nach Lys und Arg spaltet. Sie erkennen die basischen Substratkopfgruppen über Asp189, das sich am Boden der S1-Tasche befindet. Die synthetisierten Inhibitoren werden sowohl kristallographisch für beide Serinproteasen analysiert als auch thermodynamisch über isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) untersucht, um ihre Bindungseigenschaften in der S1-Tasche zu beschreiben und zu vergleichen. Ein enzymkinetischer Fluoreszenzassay unterstützt zudem die biophysikalische Charakterisierung dieser Verbindungen gegenüber beiden Proteinen. Insbesondere steht dabei die Untersuchung von Protonierungseffekten in der S1-Tasche im Vordergrund, um die Selektivitätseigenschaften von Thrombin und Trypsin genauer aufzuklären. Obwohl beide Proteasen eine sehr ähnlich aufgebaute S1-Tasche haben, deuten die Ergebnisse auf einen Unterschied in den elektrostatischen Eigenschaften von Asp189 hin, welcher mit der Substratselektivität korrelieren könnte. Es ist überraschend, dass ein Ligand aus dieser Serie im protonierten Zustand mit seiner P1-Kopfgruppe an Trypsin bindet, während dieser im Komplex mit Thrombin unprotoniert bleibt. Für diesen Liganden wird ein leichter Unterschied bezüglich seiner Solvatationsmerkmale beobachtet. Unsere Daten zeigen, dass diese Unterschiede durch die spezifische Natriumbindestelle verursacht werden können, die nur in Thrombin vorhanden ist, aber in Trypsin fehlt. Während die Unterschiede außerdem durch das geladene Glu192 am Rand der S1-Tasche in Thrombin ausgeprägt werden können, werden sie durch das ungeladene Gln192 in Trypsin nicht beeinflusst. Dabei spielt die Berücksichtigung der verschiedenen pKa-Werte der beteiligten funktionellen Gruppen ebenfalls eine wesentliche Rolle. Weiterhin werden in diesem Teil verschiedene Fragmente sowie D-Phe-Pro-Derivate im Komplex mit beiden Proteinen vorgestellt, deren Bindungseigenschaften in der S1-Tasche charakterisiert und verglichen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit (Kapitel 8-12) wird die Synthese von Aldose-Reduktase-Inhibitoren mit einem 2-Arylcarbamoylphenoxyessigsäure-Gerüst durch die Einführung von verschiedenen Benzylgruppen mit m-ständigen elektronenziehenden Gruppen (hier: Sulfoxid und Boronsäure) vorgestellt. Sie dienen zur Untersuchung der transienten Spezifitätstasche in der Aldose-Reduktase. Elektronenarme aromatische Systeme können eine Öffnung der Spezifitätstasche auslösen und zu bevorzugten Wechselwirkungen mit Trp111 führen. Um den Öffnungsmechanismus dieser transienten Bindetasche genauer zu verstehen, sollten diese synthetisierten Verbindungen auch in verschiedenen Mutationsstudien eingesetzt werden. Unsere ersten kristallographischen Ergebnisse sowie ITC-Experimente zeigen bisher keine eindeutige Interpretation dieses Mechanismus. Unterschiedliche Desolvatationseigenschaften der Inhibitoren können einen Einfluss auf den Mechanismus haben. Der dritte Teil dieser Arbeit (Kapitel 13-17) präsentiert eine weitere synthetische Untersuchung einer Serie von p-alkylierten Benzensulfonamiden und deren Etherderivaten als humane Carboanhydrase II (hCAII)-Inhibitoren, die schrittweise in ihrer Alkylkettenlänge variiert wurden. Während die Sulfonamidgruppe anionisch an Zn2+ bindet, adressiert die aliphatische Alkylkette die hydrophobe Tasche im aktiven Zentrum. Die Bindungsprozesse dieser Verbindungen an diesem Protein wurden kristallographisch, kinetisch und thermodynamisch über ITC analysiert. Es konnten Konformationsänderungen festgestellt werden, deren Effekte die Bedeutung der Formkomplementarität für die Struktur-Bindungsbeziehung aufdecken. Zusätzlich wird in diesem Teil die Synthese von perfluorierten Derivaten vorgestellt, die ein anderes Bindungsmuster in hCAII aufweisen. Sowohl eine kinetische als auch thermodynamische Untersuchung wurde ebenfalls analog zur Studie der nicht-fluorierten Serie durchgeführt. Die Acidität der Sulfonamidgruppe ist durch die stark elektronenziehenden Effekte der Fluorsubstituenten beeinflusst, die vermutlich zum unterschiedlichen Bindungsverhalten des aromatischen Systems im aktiven Zentrum des Proteins führen.

Summary:
The first part of this thesis (chapters 1-7) presents a synthetic and biophysical study of a congeneric series of D-Phe/D-DiPhe-Pro based inhibitors for thrombin and trypsin. Both proteins are structurally highly related serine proteases which show differences in their preferred substrate recognition. Thrombin is Arg-specific, whereas trypsin cleaves peptide chains after Lys and Arg. They recognize the basic substrate head group via Asp189, located at the bottom of the S1 pocket. The synthesized inhibitors are crystallographically analyzed for both serine proteases and thermodynamically investigated by isothermal titration calorimetry (ITC) to describe and compare their binding properties in the S1 pocket. An enzyme-kinetic fluorescence assay also supports the biophysical characterization of these compounds toward both proteins. In order to elucidate selectivity characteristics of thrombin and trypsin more precisely, the protonation effects were investigated in the S1 pocket. Although both proteases have a highly similar S1 pocket, our results suggest a difference in the electrostatic properties of Asp189 which may correlate with their selectivity in substrate recognition. It is surprising that one ligand of the series binds to trypsin in protonated state at its P1 head group while it remains unprotonated in case of thrombin. For this ligand, a slight difference in the residual solvation structures is observed. Our data show that these differences may be caused by the specific sodium binding site which is only present in thrombin, but absent in trypsin. This may be further pronounced by the charged Glu192 at the rim of the S1 pocket in thrombin and is not affected by the uncharged Gln192 in trypsin. Here, the consideration of different pKa values of the involved functional groups also play an essential role. Furthermore, various fragments as well as D-Phe-Pro derivatives are presented in both proteins whose binding properties in the S1 pocket are characterized and compared. The second part of this thesis (chapters 8-12) is a synthetic study of aldose reductase inhibitors with a (2-arylcarbamoyl-phenoxy)-acetic acid scaffold by varying benzyl moieties with different m-substituted withdrawing groups (here: sulfoxide and boronic acid). They are prepared for the investigation of the transient specificity pocket in aldose reductase. Electron-deficient aromatic systems can trigger an opening of the specificity pocket thus lead to favored interactions with Trp111. In order to understand the opening mechanism of this transient binding pocket, these synthesized compounds should be also used in mutagenesis studies. Our first crystallographic results and ITC experiments did not reveal any clear interpretation regarding this mechanism so far. Different desolvation properties of the inhibitors may also have an impact on this mechanism. The third part of this thesis (chapters 13-17) is another synthetic study of a series of p-alkylated benzenesulfonamides and their ether derivatives as human carbonic anhydrase II (hCAII) inhibitors which are varied in their alkyl chain length. While the sulfonamide group binds anionically to Zn2+, the aliphatic alkyl chain addresses the hydrophobic pocket in the active site. The binding events of these compounds in hCAII were investigated crystallographically, kinetically and thermodynamically by ITC. The results demonstrate the conformational changes and reveal effects of the importance of shape complementarity for the structure-binding relationship. Additionally in this part, the synthesis of perfluorinated derivatives are presented which exhibit a different binding pattern in hCAII. A kinetic and thermodynamic study was also performed analogously according to the investigation of the non-fluorinated series. The acidity of the sulfonamide group is influenced by the strongly electron-withdrawing effects of the fluorine substituents which lead to putative different binding characteristics of the aromatic system in the active site of this protein.


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