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Titel:Chemical Biology Applications of Photoresponsive DNA-Binding Agents
Autor:Heinrich, Benedikt
Weitere Beteiligte: Vázquez, Olalla (Jun. Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2020
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2020/0060
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2020-00605
DOI: https://doi.org/10.17192/z2020.0060
DDC: Chemie
Titel(trans.):Chemische Biologie Anwendungen photosensitiver DNA-bindender Verbindungen
Publikationsdatum:2021-02-25
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
CURE, photoswitches, DNA-Binder, Chemical Biology, Photoschalter, multiresistente Bakterien, Chemische Biologie, DNA, Chemische Biologie, Photoschalter, photosensitiv, DNA-binder, Nukleosom

Summary:
This thesis presents the synthesis of novel photoresponsive DNA-binding agents as well as their application for both visualization and control of biological processes. In addition, the implementation of an innovative course to transfer the interdisciplinary research culture of chemical biology to education is reported. This cumulative dissertation is mainly composed of four chapters, each of them dealing with either published or submitted articles under revision. An introduction, motivation and outlook are included, too. The first article is published in Angewandte Chemie International Edition, and describes the development of a new far-red fluorescent DNA binder, 6-TramTO-3, as an alternative chemical tool to the green fluorescent protein (GFP) for interaction studies of live multidrug-resistant pathogens and host cells. Thus, the derivatization of thiazole orange (TO) resulted in a new cyanine dye, 6-TramTO-3, whose spectroscopic properties were analyzed. DNA binding analysis by UV-vis, fluorescence and CD spectroscopy was performed to study the interaction mode upon addition to DNA. Initially, fluorescence confocal microscopy, FACS and growth curve analysis with live E. coli displayed an efficient staining of more than 90% and no effect on the bacterial viability. Importantly, 6-TramTO-3 overcomes common limitations of other frequently used fluorophores like ethidium bromide, carboxyfluorescein succinimidyl ester and SyTO-9, such as low staining efficiency and cytotoxicity without genetic manipulation. Encouraged by these unique properties, we tested 6-TramTO-3 with antibiotic-sensitive and multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae strains. 6-TramTO-3 conferred both strains a highly specific red-fluorescent shift with 91% and 87% in the 652-671 nm red2 channel without observable cytotoxic effects. Next, we performed phagocytosis assays with human macrophages, which revealed a different strain behavior for the first time. Besides the publication, an European patent was filed (18174086.1 – 1011) and numerous collaborations with universities, research institutes and companies were initiated to apply 6-TramTO-3 in different contexts. The second article is published in Organic & Biomolecular Chemistry, and presents ortho-tetra-fluoroazobenzene derivatives as DNA intercalators for photocontrol of DNA and nucleosome binding upon visible-light irradiation. Its use is less harmful to biological systems and therefore, preferred over UV-light, which is needed for the most known nucleic acid targeting photoswitchable systems. Thus, the introduction of such moiety in the backbone of the minor groove binder netropsin added dynamic control and changed the recognition mode. UV-vis, HPLC and NMR analysis demonstrated the photoisomerization of the new compounds by visible light. DNA-binding analysis conducted by UV-vis, fluorescence and CD spectroscopy revealed an intercalating binding mode in the low nM-region with differences between isomers. Finally, the use of the new derivative as a light-controllable nucleosome binder was explored. The different binding affinities observed on free DNA were corroborated for the nucleosomal DNA. Interestingly, electromobility shift assays and dynamic light scattering experiments proved that when the compound is in its trans-form, it intercalated into the nucleosomal DNA, induced distortion, which further led to disruption of the nucleosomes. These findings will help to introduce photochemical control to pave the way to altering nucleosome-based processes by light. The third chapter of this thesis is a submitted manuscript to the journal Organic Letters under revision and deals with a novel synthetic approach to access pyrrole-imidazole (Py-Im) DNA binding polyamides based on 4-methyltrityl (Mtt) solid-phase peptide synthesis (SPPS). Commonly Py-Im polyamide hairpins are synthesized by Boc- and Fmoc- SPPS. New Mtt-protected pyrrole and imidazole building blocks were synthesized with higher yields than the Boc- and Fmoc-analogues. Their implementation could successfully be shown by the synthesis and study of a DNA-binding polyamide applying all Mtt-building blocks. Our methodology is orthogonal to Fmoc and will allow the implementation of base labile compounds and other sensitive groups in Py-Im polyamide chemistry affording novel polyamide conjugates. In a further attempt, it was already possible to use the new building blocks for the introduction of a photoswitchable compound into the polyamide-hairpin backbone, which will access the introduction of dynamic and spatial control in the level of sequence specific DNA binding in biological assays. The fourth chapter is a submitted manuscript to the Journal of Chemical Education under replied revision, in which a novel course for master students in chemistry and biology is introduced to fill the missing gap between cutting-edge interdisciplinary research and education of future scientists. In other words, our course aimed at bringing the authentic “big picture” of science by the combination of lectures, a discovery-based research laboratory and science communication. The students experienced the advantages of collaborative work, wrote a short article and were guided in the design and defense of their own research proposals in chemical biology. Evaluation of the course clearly proved that the course fosters cooperative research relationships between biology and chemistry students, provides a unique and genuine research experience and increased the students’ interest in interdisciplinary approaches and collaborative work. The course and assessment material was accessible to inspire other interdisciplinary fields

Zusammenfassung:
In der vorliegenden Thesis werden die Synthese innovativer photoregulierbarer DNA-bindender Verbindungen sowie deren Anwendung zur Visualisierung und Steuerung biologischer Prozesse vorgestellt. Darüber hinaus wird über die Implementierung eines neuartigen Kurses zur Übertragung der interdisziplinären Forschungskultur der Chemischen Biologie auf die Lehre berichtet. Diese kumulative Dissertation besteht hauptsächlich aus vier Kapiteln, die sich jeweils mit veröffentlichten oder in Revision stehenden Artikeln befassen. Zudem umfasst die Arbeit eine Einleitung, eine Motivation und je Kapitel einen Ausblick. Der erste Artikel wurde in der Angewandten Chemie International Edition veröffentlicht und beschreibt die Entwicklung einer neuen tiefrot fluoreszierenden DNA-bindenden Verbindung 6-TramTO-3 als alternatives chemisches Instrument zum Grün-Fluoreszierenden-Protein (GFP) für Interaktionsstudien mit lebenden multiresistenten Krankheitserregern und Wirtszellen. Basierend auf der Grundstruktur des Thiazoloranges (TO) wurde ein neuer Cyaninfarbstoff, 6-TramTO-3, entwickelt, dessen spektroskopische Eigenschaften untersucht wurden. Eine DNA-Bindungsanalyse durch UV-vis-, Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie wurde durchgeführt, um den Bindungsmodus nach Zugabe von DNA zu untersuchen. Konfokale Fluoreszenzmikroskopie, FACS und Wachstumskurvenanalyse mit lebenden E. coli zeigten eine effiziente Färbung von 93% und keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Bakterien. Entscheidend dabei ist, dass 6-TramTO-3 die üblichen Problematiken anderer häufig verwendeter chemischer Fluorophore wie Ethidiumbromid, Carboxyfluorescein-Succinimidylester und SyTO-9, wie geringe Färbungseffizienz und Zytotoxizität ohne genetische Manipulation überwindet. Aufgrund dieser herausragenden Eigenschaften haben wir 6-TramTO-3 im Weiteren mit Antibiotika-sensitiven wie auch multiresistenten Klebsiella pneumoniae-Stämmen getestet. 6-TramTO-3 verlieh beiden Stämme eine hochspezifische rot-fluoreszierende Verschiebung mit 91% und 87% in den 652-671 nm roten Kanal, ohne die Viabilität zu beeinflussen. Als nächstes führten wir Phagozytosetests mit menschlichen Makrophagen durch, wobei erstmalig ein unterschiedliches Wirtsverhalten gezeigt werden konnte. Neben der Veröffentlichung des Fachartikels wurden ein europäisches Patent angemeldet (18174086.1 - 1011) und zahlreiche Kooperationen mit Universitäten, Forschungsinstituten und Unternehmen initiiert, um 6-TramTO-3 in diversen Zusammenhängen anzuwenden. Der zweite Artikel wurde in Organic & Biomolecular Chemistry veröffentlicht und stellt ortho-Tetrafluorazobenzolderivate als DNA-Interkalatoren für die photokontrollierbare Bindung an der DNA und den Nukleosomen durch Bestrahlung mit sichtbarem Licht vor. Dieses ist für biologische Systeme weniger schädlich und daher UV-Licht vorzuziehen, welches für die die Regulierung der bekanntesten photoschaltbaren nukleinsäurebindenden Systeme benötigt wird. Die Einführung einer solchen Einheit in das Grundgerüst des kleine Furchen bindenden Netropsins führt zu einer dynamischen Kontrolle und änderte den Erkennungsmodus. UV-Vis-, HPLC- und NMR-Analyse zeigten die Photoisomerisierung der neuen Verbindungen. Eine DNA-Bindungsanalyse mittels UV-Vis-, Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie ergab einen interkalierenden Bindungsmodus mit Affinitäten im niedrigen nM-Bereich und Unterschieden zwischen den Isomeren. Schließlich wurde die Verwendung des neuen Derivats als lichtkontrollierbare nukleosomenbindende Substanz untersucht. Die bei freier DNA beobachteten unterschiedlichen Bindungsaffinitäten wurden für die nukleosomale DNA bestätigt. Interessanterweise zeigten Elektromobilitäts-Shift-Untersuchungen und dynamische Lichtstreuungsexperimente, dass die trans-Form der Verbindung eine Aufweitung der nukleosomalen DNA induzierte, die zur Entwindung der Nukleosomen führte. Diese Erkenntnisse werden dazu beitragen, eine photochemische Kontrolle einzuführen, um den Weg zur Veränderung von nukleosomenbasierten Prozessen durch Licht zu ebnen. Das dritte Kapitel dieser Arbeit ist ein in Revision stehendes Manuskript im Journal Organic Letters und befasst sich mit einem neuartigen Syntheseansatz der Pyrrol-Imidazol (Py-Im)-DNA-bindende Polyamide auf der Basis von 4-Methyltrityl (Mtt) Festphasenpeptidsynthese (SPPS) zugänglich macht. Üblicherweise werden Py-Im-Polyamid-Haarnadeln durch Boc- und Fmoc-SPPS synthetisiert. Neue Mtt-geschützte Pyrrol- und Imidazol-Bausteine wurden mit höheren Ausbeuten als die entsprechenden Boc- und Fmoc-Analoga synthetisiert. Ihre Anwendung konnte durch die Synthese und Untersuchung eines DNA-bindenden Polyamids unter Einsatz der Mtt-Bausteine erfolgreich gezeigt werden. Unsere Methode ist orthogonal zu Fmoc und ermöglicht die Implementierung basenlabiler Verbindungen und anderer empfindlicher Gruppen in der Py-Im-Polyamidchemie, wodurch neue Polyamidkonjugate erhalten werden können. In einem weiteren Versuch war es bereits möglich, die neuen Bausteine für die Einführung einer photoschaltbaren Verbindung in das Polyamid-Haarnadel-Rückgrat zu verwenden, die die Einführung von dynamischer und räumlicher Kontrolle der sequenzspezifischen DNA-Bindung in biologischen Untersuchungen ermöglicht. Das vierte Kapitel ist ein in bearbeiteter Revision stehendes Manuskript im Journal of Chemical Education, welches einen neuartigen Kurs für Masterstudenten in den Fächern Chemie und Biologie vorstellt, um die vorhandene Lücke zwischen interdisziplinärer Spitzenforschung und der Ausbildung künftiger Wissenschaftler zu schließen. Mit anderen Worten, der Kurs zielte darauf ab, durch die Kombination von Vorlesungen, einem entdeckungsbasierten Forschungslaborkurses und wissenschaftlicher Kommunikation das authentische „Gesamtbild“ der Wissenschaft zu vermitteln. Die Studierenden erlebten die Vorteile von Kollaborationen, verfassten einen kurzen Artikel und wurden bei der Konzeption und Präsentation ihrer eigenen Forschungsvorschläge in der Chemischen Biologie angeleitet. Die Evaluation des Kurses zeigte eindeutig, dass die Lehrveranstaltung kooperative Forschungsbeziehungen zwischen Biologie- und Chemiestudenten fördert, ein einzigartiges und echtes Forschungserlebnis bietet und das Interesse der Studierenden an interdisziplinären Ansätzen und gemeinsamer Arbeit erhöht. Das Kurs- und Bewertungsmaterial wird zugänglich sein, um andere interdisziplinäre Wissenschaftsbereiche zu inspirieren ähnliche Kurse durchzuführen.


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