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Titel: Characterization of DNA interference by a minimal Type I-F CRISPR-Cas system
Autor: Müller Esparza, Hanna Constanza
Weitere Beteiligte: Randau, Lennart (Dr.)
Veröffentlicht: 2019
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0493
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-04933
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0493
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Characterisierung der DNA Interferenz des minimalen Typ I-F CRISPR-Cas System
Publikationsdatum: 2020-05-25
Lizenz: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
CRISPR-Cas, Mikrobiologie, SPT-PALM, CRISPR, anti-CRISPR

Summary:
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) proteins constitute the only known adaptive immune system present in Archaea and Bacteria. This system targets and degrades foreign genetic material through ribonucleoprotein effector complexes carrying CRISPR RNAs (crRNAs), in a process termed interference. CRISPR-Cas systems are classified into 6 different types, with Type I systems being the most widespread in nature. They harbour the Cas3 helicase/nuclease as signature protein, involved in target degradation, and can be divided into 7 subtypes (A-F, U). They elicit interference by ribonucleoprotein complexes (termed CRISPR associated complexes for anti-viral defence, Cascades), formed of Cas proteins and a single crRNA. Cascades are able to discriminate between self and non-self substrates by identifying a short Protospacer Adjacent Motif (PAM) next to the crRNA target (termed protospacer). In Type I-F systems, PAM recognition is carried out by Cas8f (or large subunit). In the present work, we analysed a smaller variant of a Type I-F CRISPR-Cas system, identified in Shewanella putrefaciens CN-32. This system lacks a large subunit and contains two previously uncharacterised Cas proteins, functionally identified as Cas5 and Cas7 homologues. We expressed the complex in Escherichia coli BL21-AI and demonstrated its activity against bacteriophages and plasmids in a sequence-, PAM- and Cas3-dependent manner. This heterologous activity indicates that interference can be carried out without the need of a large subunit or additional proteins from S. putrefaciens. Furthermore, we were able to identify a unique alpha helical domain in Cas5fv responsible for stringent GG PAM identification from the major groove side, in addition to Cas7fv-mediated non-target strand stabilisation. We also determined the binding affinities of the complex through BioLayer Interferometry (BLI), gaining insights into its target requirements. Moreover, we studied the dynamics of the minimal system through Single-Particle Tracking Photo-activated Localization Microscopy (sptPALM), revealing an unspecific DNA-binding capacity of the alpha helical domain of Cas5fv, as well as RNA interactions of Cas5fv and Cas6f. For Cascades, we determined the binding times to genomic targets, which were directly proportional to the complementarity between crRNA and DNA. Fully complementary targets elicited a binding duration of around 15 seconds. We propose that this minimised Cascade version is an evolutionary response to the appearance of viral Anti-CRISPR (Acr) proteins, small proteins able to block CRISPR-Cas interference. The effect of a broad-spectrum Acr protein, AcrF9, on the minimal complex was tested. Neither a reduction of interference activity nor physical interactions were detected. This supports the hypothesis of complex reduction as a response to Acr pressure.

Zusammenfassung:
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) und CRISPR-assoziierte (Cas) Proteine stellen das einzige in Bakterien und Archaeen bekannte adaptive Immunsystem dar. Hierbei kann ein Organismus mit Hilfe von Ribonukleoproteinkomplexen, die mit kleinen CRISPR RNAs (crRNAs) ausgestattet sind, fremde Nukleinsäuren erkennen und degradieren. Dieser Vorgang wird als Interferenz bezeichnet. CRISPR-Cas Systeme werden in sechs verschiedene Typen klassifiziert. Die Systeme des Typs I sind in der Natur am weitesten verbreitet; sie bestehen aus sieben Untertypen (A-F, U) und ihr gemeinsames Erkennungsmerkmal ist die Ziel-DNA Helikase/Nuklease Cas3. Alle Typ I-Systeme führen Interferenz mit Hilfe eines Ribonukleoproteinkomplexes (genannt CRISPR associated complex for antiviral defence, Cascade) aus, welcher aus mehreren Cas-Proteinen sowie einer einzigen crRNA besteht. Die Cascade-Komplexe können hierbei zwischen eigenen und fremden Nukleinsäuren unterscheiden, indem sie die PAM (Protospacer Adjacent Motif) identifizieren. Dabei handelt es sich um eine kurze, neben dem Protospacer liegende Sequenz, die wiederum neben der zur crRNA komplementären Region liegt. In Systemen des Typs I-F wird die Erkennung der PAM von der großen Untereinheit Cas8f ausgeführt. Die vorliegende Arbeit analysiert eine minimale Variante des Typ I-F CRISPR-Cas Systems, die in Shewanella putrefaciens CN-32 entdeckt wurde. Während dieser minimalen Variante die große Untereinheit fehlt, enthält sie zwei zuvor unbekannte Cas-Proteine, die in einer vorangehenden Arbeit als funktionelle Homologe von Cas5 und Cas7 identifiziert wurden. Der minimale Cascade-Komplex wurde in Escherichia coli BL21 AI exprimiert. Seine Interferenz-Aktivität sowohl gegen Bakteriophagen als auch gegen Plasmide konnte als sequenz-, PAM- und Cas3-abhängig nachgewiesen werden. Dies beweist, dass für die Interferenz weder die Cas8-Untereinheit, noch andere Proteine aus S. putrefaciens notwendig sind. Durch strukturelle Analysen konnte des Weiteren eine alpha-helikale Domäne des Cascade-Proteins Cas5fv identifiziert werden, welche für die Erkennung der GG PAM aufseiten der großen Furche verantwortlich ist, sowie die Stabilisierung des Nicht-Ziel-Stranges durch Cas7fv-Untereinheiten. Außerdem wurde die Bindungskinetik des Komplexes mit Hilfe von BioLayer Interferometry (BLI) bestimmt. Dies gewährt uns Einsicht in die strukturellen Anforderungen, die der Cascade-Komplex an seine Substrate stellt. Weiterhin wurde Single-Particle Tracking Photo-Activated Localization Microscopy (sptPALM) verwendet, womit eine unspezifische DNA-Bindungskapazität der alpha-helikalen Domäne von Cas5fv aufgedeckt werden konnte, sowie die Fähigkeit von Cas5fv und Cas6f mit RNA zu interagieren. Bei den Cascade-Komplexen wurden die Bindungszeiten an genomische Ziele bestimmt, die sich direkt proportional zur Komplementarität von crRNA und DNA verhielten. Vollständig komplementäre Ziele lösten eine Bindung von 15 Sekunden aus. Wir schlagen vor, dass dieser minimale Cascade-Komplex eine evolutionäre Antwort auf das Entstehen von viralen Anti-CRISPR-Proteinen (Acr-Proteine) ist. Dies sind kleine Proteine, welche die CRISPR-Cas Interferenz auf verschiedenen Wegen blockieren können. Die Wirkung des vielseitigen Acr-Proteins AcrF9 auf den minimalen Komplex wurde untersucht und es konnte weder eine Abnahme der Interferenz, noch eine anderweitige physikalische Interaktion gezeigt werden. Dies bestätigt die Annahme, dass selektiver Druck durch die Entstehung der Acr-Proteine eine Reduzierung der Cascade-Komplexe zur Folge hat.


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