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Zusammenfassung:
Zum Schutz vor osmotischem Stress akkumuliert Bacillus subtilis kompatible Solute um den Zellturgor aufrecht zu erhalten. Eines dieser kompatiblen Solute ist Glycinbetain, das entweder durch die Opu-Transporter aus der Umwelt aufgenommen werden kann, oder ausgehend von dem zuvor importierten Vorläufer Cholin durch die Dehydrogenasen GbsB und GbsA synthetisiert werden kann. Stromaufwärts des gbsAB Operons ist das Gen gbsR lokalisiert, das für einen Cholin-abhängigen MarR-Typ Repressor kodiert, der sowohl die Expression des gbsAB Operons als auch das Gencluster des Cholin-spezifischen ABC-Transporters OpuB kontrolliert (Nau-Wagner et al., 2012). Dieser Regulator vermittelt die Repression seiner Zielgene durch einen “Road-Block” Mechanismus, wofür ein „inverted repeat“ stromabwärts des gbsAB und opuB Transkriptionsstarts gebunden wird. Eine Mutagenesestudie auf Basis eines Homologiemodels des dimeren GbsR Proteins zeigte, dass Cholin durch eine aromatische Ligundenbindetasche in GbsR gebunden wird. Diese ähnelt den Bindetaschen aus Substratbindeproteinen, die mit ABC-Transportern für kompatible Solute assoziiert sind. Umfangreiche bioinformatische Analysen zeigten, dass GbsR den Prototyp für eine neue Sub-Familie der MarR-Typ Regulatoren darstellt. Diese beinhaltet Regulatoren, die mit der Glycinbetain Synthese, Aufnahmesystemen für kompatible Solute und Sauerstoff Reduktasen des Cytochrom bd-Typs assoziiert sind. Die Regulatoren sind innerhalb der Bacteria und Archae weit verbreitet. In B. subtilis sind Gene für GbsR-Typ Regulatoren mit den nahe verwundten Operonen opuB (YvaV) und opuC (OpcR) assoziiert (Nau-Wagner et al., 2012; Lee et al., 2013). Die beiden Gencluster zeigen ein sehr unterschiedliches Expressionsmuster in Antwort auf verschiedene extrazelluläre Salinitäten. Jedoch teilen sie die Regulation durch den GbsR-Typ Repressor OpcR, der in die Reetablierung der opuC Repression unter Hochsalzbedingungen involviert ist. Diese Funktion steht im Einklang mit der osmotischen Induktion des opcR Gens. Die Expression des opuB und opuC Operons ist zudem, durch den Regulator RemA, der als Aktivator der Biofilmmatrix Synthese agiert, mit der Biofilmbildung verknüpft (Winkelman et al., 2013). In B. subtilis ist kein GbsR-Typ Regulator mit dem opuA Operon assoziiert. Dies ist jedoch der Fall in dem marinen Bakterium Bacillus infantis. OpuAR wird durch ein Gen in direkter Nachbarschaft des opuA Genclusters kodiert und agiert als Cholin- und Glycinbetain-abhängiger Repressor der opuA Expression. Im Gegensatzt zu zuvor untersuchten Aufnahmesystemen für kompatible Solute zum Zweck der Osmoprotektion wird die opuA Transkription nicht durch erhöhte Osmolaritäten induziert. Stattdessen findet eine Induktion in Gegenwart der Substrate des Transporters statt. Zusammenfassend demonstrieren die Argebnisse der vorliegenden Arbeit die hochgradig komplexe Regulation von Bakteriellen Anpassungsmechanismen, die das Überleben der Zelle unter osmotisch ungünstigen Bedingungen sicherstellen.

Summary:
Confronted with hyperosmotic stress, the soil bacterium Bacillus subtilis accumulates compatible solutes to maintain cell turgor. Glycine betaine is such a compatible solute that can either be taken up from the environment by various Opu-transporters or can be synthesized from the prior imported precursor choline by the dehydrogenases GbsB und GbsA. Upstream of the gbsAB gene cluster, the gbsR gene is located which encodes a MarR-type choline-responsive repressor regulating the expression of the gbsAB operon as well as the opuB operon, encoding a choline-specific ABC-Transporter (Nau-Wagner et al., 2012). This regulator mediates repression of its target genes through a road block mechanism by binding at an inverted repeat downstream of the transcriptional start site of the gbsAB und the opuB operons. A comprehensive targeted mutagenesis study based on a homology model of the dimeric GbsR protein provided evidence that choline is bound by an aromatic cage present in GbsR, which presumably matches that of substrate binding proteins acting in conjunction with ABC-Transporters. Extensive bioinformatic analyses highlighted GbsR as the prototype for a new sub-family of MarR-type regulators including members which are associated with glycine betaine sysnthesis, uptake systems for compatible solutes or oxygen reductases of the cytochrome bd-type. These types of proteins are frequently found among Archaea und Bacteria. Genes for GbsR-type regulators associated with the closely related opuB (YvaV) und the opuC (OpcR) operon are present in B. subtilis (Nau-Wagner et al., 2012; Lee et al., 2013). Both geneclusters show a strikingly different expression pattern in response to extracellular salinities. However, they share the regulation through the GbsR-type repressor OpcR, which is involved in the re-establishment of opuC repression under high salt concentrations, a function in agreement with the salt-induced expression of the opuCR gene itself. The expression of the opuB und opuC operon is connected to the formation of biofilms throught the regulatory protein RemA, which acts as an activator of biofilm matrix synthesis, but also as an activator of the opuB und opuC transcription (Winkelman et al., 2013). In B. subtilis no GbsR-type regulator is connected to the opuA operon. However, this is the case in the marine bacterium Bacillus infantis. OpuAR is encoded next to the opuA genecluster und acts as a choline- und glycine betaine-responsive repressor of opuA expression. In contrast to previously studied osmostress protectant uptake systems, opuA transcription in B. infantis is not enhanced in the presence of elevated osmolarities, but through the presence of its substrates. Taken together, this work demonstrates the highly complex regulatory mechanisms leeding to the survival of bacteria under osmotically unfavourable conditins.

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