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Titel:Investigation on Cyclodipeptide Formation and Metabolism in Actinomycetes and Application of Fungal Prenyltransferases in the Chemoenzymatic Synthesis
Autor:Yu, Huili
Weitere Beteiligte: Li, Shu-Ming (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2018
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2018/0497
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2018-04975
DOI: https://doi.org/10.17192/z2018.0497
DDC:615 Pharmacology & therapeutics, prescription drugs
Titel(trans.):Untersuchungen zur Entstehung und Metabolismus von zyklischen Dipeptiden in Aktinomyzeten sowie Anwendungen von pilzlichen Prenyltransferazen in der chemoenzymatischen Synthese
Publikationsdatum:2018-10-22
Lizenz:https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Dokument

Schlagwörter:
Untersuchungen zur Entstehung und Metabolismus von zyklischen Dipeptiden in Aktinomyzeten sowie Anwendungen von pilzlichen Prenyltransferazen in der c, chemoenzymatischen Synthese, Prenyltransferazen, Aktinomyzeten, P450, CDPS, zyklischen Dipeptiden, Investigation on Cyclodipeptide Formation and Metabolism in Actinomycetes and Application of Fungal Prenyltransferases in the Chemoenzymatic Synthesis

Summary:
Secondary metabolites originated from plants, bacteria and fungi constitute a large group of compounds, which are not directly related to the growth, development and reproduction of the organism. However, the producer can benefit from these metabolites to defend itself against natural enemies, competitors or environmental pressure. Furthermore, they often exhibit useful and interesting biological and pharmaceutical activities, which provide benefits to human health and life. For example, cyclodipeptides (CDPs) and their derivatives have gained increasing attention for their interesting and diverse pharmaceutical activities. Natural CDPs are mainly formed by nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) or cyclodipeptide synthases (CDPSs). The CDP cores resulted from the NRPS or CDPS pathways are often further modified by varieties of tailoring enzymes leading to the formation of sophisticated natural products. The small size of CDPSs (200−300 residues) makes them genetically easily manipulated in synthetic biology. In the first project of this thesis, a cooperation project with Jing Liu, nine new CDPS genes from eight Streptomyces strains were functionally characterized after cloning into pET28a vector and expressing in E. coli. The products were analyzed on LC-MS and then isolated for NMR analysis. The products were identified as tryptophan-containing cyclodipeptides (cWXs) that are the most common precursors of diketopiperazines (DKPs) with pharmaceutical interest, due to the various modification possibilities on the indole ring. The nine identified CDPSs include six specific CDP synthases consisting of one cWL synthase, two cWP synthases and three new cWW synthases as well as three unspecific CDPSs producing several products with cWA or cWY as the major cyclodipeptide. Total product yields of CDPs were calculated based on HPLC analysis to be 46 to 211 mg/L E. coli culture. Our findings represent rare examples of cWXs derived from CDPS pathways in actinobacteria. This study also provides a valid experimental basis for further combination of CDPSs with other tailoring enzymes in biosynthesis of interesting compounds. The three identified cWW synthases from Streptomyces purpureus NRRL B-5737, Streptomyces lavendulae NRRL B-2774, and Streptomyces xanthophaeus NRRL B-5414 are genetically associated with a putative cytochrome P450. The three P450 homologues share sequence identities of more than 75% with each other on the amino acid level, indicating same or very similar function. As a representative, the function of P450NB5737 from S. purpureus was identified by heterologous expression in Streptomyces coelicolor and in vitro assays with the recombinant protein produced in E. coli. Isolation and structure elucidation confirmed that P450NB5737 catalyzes the transfer of a guanine moiety onto the indole ring of cWW via a C–N bond, leading to unprecedented adducts of cyclodipeptide with a nucleobase. This represents one additional example of rare P450 enzymes catalyzing the coupling of two different substrates. Besides CDPs, prenylated aromatic products often possess various biological and pharmacological activities, in comparison to their non-prenylated precursors. The prenyltransferases of the DMATS superfamily show broad flexibility toward aromatic substrates, but relatively strict prenyl donor tolerance. They usually accept only DMAPP, but not GPP or other prenyl donors with a longer chain length. To broaden the prenyl donor spectra, the acceptance of tyrosine O-prenyltransferases TyrPT and SirD towards unnatural DMAPP analogs such as MAPP, 2-pen-PP, and benzyl-PP was tested in the presence of tyrosine and its derivatives. The results revealed that TyrPT and SirD also use the unnatural donors and exhibit similar behavior as their natural prenyl donor DMAPP. Alkylated or benzylated products at the same positions of that with DMAPP have therefore been identified. This study increased significantly the diversity of prenylated products by chemoenzymatic synthesis. The results presented in this thesis contributed significantly to the formation and metabolism of tryptophan-containing CDPs in nature and expanded the potential application of prenyltransferases. They provide a solid basis for applications in the synthetic biology in the future. 

Zusammenfassung:
Sekundärmetabolite aus Pflanzen, Bakterien und Pilzen stellen eine große Substanzklasse dar, die nicht direkt mit Wachstum, Entwicklung und Reproduktion des Organismus zusammenhängen. Jedoch kann der Produzent sich diese Metaboliten zu Nutze machen, um sich vor natürlichen Feinden, Konkurrenten oder Umwelteinflüssen zu schützen. Darüber hinaus weisen sie oft nützliche und interessante biologische und pharmazeutische Aktivitäten auf, wovon die menschliche Gesundheit und das Leben profitieren können. Zum Beispiel haben zyklische Dipeptide (CDPs) und ihre Derivate an zunehmender Aufmerksamkeit in Bezug auf ihre interessanten und vielfältigen pharmazeutischen Aktivitäten gewonnen. Natürlich vorkommende CDPs werden in der Regel von nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPSs) oder Cyclodipeptidsynthasen (CDPSs) gebildet. Die von der NRPS- oder CDPS-Synthesewege gebildeten CDP-Grundstrukturen werden häufig mithilfe von verschiedenen „Tailoring enyzmes“ weiter modifiziert, sodass komplexere Naturstoffe entstehen. Wegen ihrer geringen Größe (200–300 Aminosäuren) können CDPSs gentechnisch leicht manipuliert werden. In dem ersten Projekt dieser Arbeit, einem Kooperationsprojekt mit Jing Liu, wurden neun neue CDPS-Gene aus acht Streptomyceten-Stämmen jeweils in einen pET28a Vektor kloniert und in E. coli exprimiert. Die Produkte wurden mittels LC-MS analysiert und anschließend für die Strukturaufklärung isoliert. Die Produkte wurden als zyklische Dipeptide mit einer Tryptophaneinheit (cWXs) identifiziert. Diese sind pharmazeutisch besonders interessant, da sie vielseitig am Indolring modifiziert werden können. Sechs der neun identifizierten CDPSs sind spezifische CDP-Synthasen, davon eine cWL Synthase, zwei cWP Synthasen und drei neuen cWW Synthasen, sowie drei unspezifische CDPSs, die cWA oder cWY als Hauptprodukt, bilden. Die Gesamtmenge an produzierten CDPs von 46 bis 211 mg/L in E. coli Kultur wurde mittels HPLC berechnet. Unsere Ergebnisse repräsentieren seltene Beispiele an cWXs, die aus den CDPS-Synthesewegen von Actinobakterien hervorgehen. Diese Arbeit liefert auch eine valide experimentelle Grundlage für weitere Kombinationen von CDPSs mit anderen modifizierende Enzymen in der synthetischen Biologie. Die drei identifizierten cWW-Synthasen aus Streptomyces purpureus NRRL B-5737, Streptomyces lavendulae NRRL B-2774 und Streptomyce xanthophaeus NRRL B-5414 sind genetisch mit putativen Cytochrom P450 Enzymen assoziiert. Die drei P450 Homologe weisen untereinander eine Identität der Aminosäuresequenz von mehr als 75% auf, was auf die gleiche oder eine sehr ähnliche Funktion hindeutet. Als repräsentativer Vertreter der drei P450s wurde die Funktion von P450NB5737 aus S. purpureus durch heterologe Expression in Streptomyces coelicolor, sowie mithilfe von in vitro Assays mit dem rekombinanten Protein untersucht. Die Übertragung einer Guanineinheit auf den Indolring von cWW mit Ausbildung einer C–N-Bindung durch P450NB5737 wurde nach Isolierung und anschließender Strukturaufklärung bestätigt. Diese Verknüpfung stellt die Katalyse eines noch nie nachgewesenen Addukts zwischen einem zyklisches Dipeptid mit einer Nukleinbase dar. Dies ist ein weiteres Beispiel von seltenen P450 Enzymen, welche die Verknüpfungen zwei unterschiedlicher Substrate katalysierten. Im Vergleich zu ihren nicht prenylierten Vorläufern, zeigen prenylierte aromatische Produkte oft diverse biologische und pharmazeutische Aktivitäten. Die Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie sind ihren aromatischen Substraten gegenüber sehr flexibel, allerdings weisen sie ihrem Prenyldonor gegenüber nur eine geringe Toleranz auf. In der Regel akzeptieren sie nur DMAPP, jedoch nicht GPP oder andere Prenyldonoren mit einer noch längeren Kettenlänge. Um das Spektrum des Prenyldonors zu erweitern, wurde die Akzeptanz von zwei Tyrosin-O-Prenyltransferasen TyrPT und SirD gegenüber unnatürlichen DMAPP Analoga wie MAPP, 2-pen-PP und Benzyl-PP in Anwesenheit von Tyrosin und Derivaten getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass TyrPT und SirD auch die Übertragung der unnatürlichen Donoren katalysieren und dabei ein ähnliches Verhalten wie mit dem natürlichen Prenyldonor DMAPP beibehalten. Produkte, die die Alkyl- bzw. Benzylgruppe an denselben Positionen wie mit DMAPP tragen, wurden daher identifiziert. Diese Arbeit trägt erheblich zur Vielfalt von prenylierten Produkten durch chemoenzymatische Synthese bei. Die Ergebnisse dieser Dissertation tragen maßgeblich zur Bildung und zum Metabolismus von tryptophanhaltigen CDPs in der Natur bei, sowie die Erweiterung potenzieller Anwendungen von Prenyltransferasen. Darüber hinaus bilden sie eine solide Grundlage für zukünftige Anwendungen in der synthetischen Biologie.


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