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Titel:Integration of biomolecular logic principles with electronic transducers on a chip
Autor:Molinnus, Denise
Weitere Beteiligte: Schöning, Michael J. (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2018
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2018/0495
DOI: https://doi.org/10.17192/z2018.0495
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2018-04950
DDC: Pharmacology & therapeutics, prescription drugs
Titel(trans.):Systemintegration biomolekularer Logik-Prinzipien mit elektronischen Transduktoren auf einem Chip
Publikationsdatum:2018-10-22
Lizenz:https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Catecholamine, Acetoin, Glucose, Biosensor, Adrenalin, Laccase, Butandion <2,3->, Hydrogel, Enzym, Sauerstoffsensor, Chemischer Sensor, Ing

Summary:
Boolean operations applied in biology and integrated with electronic transducers allow the development of a new class of digital biosensors for the detection of multiple input signals simultaneously and in real-time. With the help of Boolean functions (AND, OR, etc.), an electrical output signal will be directly delivered, representing a ”1” or “0” binary notation, corresponding to a “true” or “false” statement, respectively. Such digital biosensors have the future potential to create medical devices and systems for intelligent or smart diagnostics. The present thesis describes the realization of different enzyme-based biomolecular logic gates combined with electronic transducers for the possible application in medicine or food industry. In a first concept, a so called BioLogicChip is developed combining a “sense-act-treat” function integrated on one chip. The present system exemplarily mimics an “artificial pancreas” designed as a closed-loop drug-release system. A glucose sensor is constructed as enzyme-based AND logic gate, a temperature-depending hydrogel imitates the actuator function switching ON and OFF with its shrinking or swelling property, and an additional insulin sensor is developed to monitor and control the release of the drug (here: insulin) from the actuator. In this study, the results of the individual components such as the amperometric glucose sensor, the temperature-dependent hydrogel and the amperometric insulin sensor are presented, which are necessary to create such BioLogicChip. Moreover, a digital adrenaline biosensor is developed to proof the catheter position during adrenal vein sampling. The sensor consists of an oxygen electrode modified by a bi-enzyme system with the enzymes laccase and pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (PQQ-GDH) to realize substrate-recycling principle to detect low adrenaline concentrations (in the nanomolar concentration range). The sensor`s behavior at different pH values and at different temperatures is studied. Measurements in Ringer`s solution are performed. In addition, the sensitivity of the biosensor to other catecholamines such as noradrenaline, dopamine and dobutamine is investigated. Furthermore, the adrenaline biosensor is successfully examined in human blood plasma. Finally, “proof-of-principle” experiments have been performed by combining the adrenaline biosensor with Boolean operations to get a rapid qualitative statement of the presence or absence of adrenaline, thus validating the correct position of the catheter in a YES/NO form. This adrenaline biosensor is further miniaturized as a thin-film platinum adrenaline biosensor. Here, the bioelectrocatalytical measurement principle is applied by immobilization of the enzyme PQQ-GDH to detect adrenaline in the nanomolar concentration range, too. The measurement conditions such as pH value, glucose concentration in the analyte solution and temperature are optimized with regard to a high sensitivity and low detection limit. Also, this sensor has been verified towards other catecholamines (noradrenaline, dopamine and dobutamine). The platinum thin-film adrenaline biosensor is successfully applied in blood plasma for the detection of different spiked adrenaline concentrations. Furthermore, the developed adrenalin biosensor is able to detect the concentration difference between adrenal blood and peripheral blood. In contrast to the above-mentioned amperometric biosensor examples for biomolecular gates, also a field-effect-based platform is given attention in this thesis. The field-effect electrolyte-insulator-semiconductor (EIS) sensor consists of a layer structure of Al/p-Si/SiO2/Ta2O5 and is used to create an acetoin biosensor for the first time to control different fermentation processes. The sensor chip is modified by the enzyme acetoin reductase from B. clausii DSM 8716T for the catalytical reaction of (R)-acetoin to (R,R)-butanediol and meso-butanediol, respectively, in the presence of NADH. The linear measurement range, the optimal immobilization strategy (cross-linking by using glutaraldehyde and adsorptive binding) as well as the optimal working pH value and long-term stability are investigated by means of constant-capacitance measurements. Finally, the acetoin sensor was successfully applied in wine probes to detect different spiked acetoin concentrations. The sensor shows opportunities to be further developed as digital acetoin biosensor.

Zusammenfassung:
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Konzepte mit biologischen Schaltungen, die auf elektronischen Transducern integriert sind, entwickelt. Damit können neuartige digitale Biosensoren aufgebaut werden, die in Abhängigkeit der Eingangssignale ein elektrisches Ausgangssignal generieren. Als erstes Konzept wird ein "BioLogicChip" vorgestellt, der die "Sense-act-treat"-Funktion auf einem Chip kombiniert. Mit diesem BioLogicChip soll es möglich sein, eine bestimmte Krankheit abhängig von spezifischen Biomarkern zu diagnostizieren. Gleichzeitig soll mit diesem Chip eine bestimme Menge des benötigten Wirkstoffs dem Patienten verabreicht werden können. In dieser Arbeit wurde das Konzept exemplarisch als "künstliche Pankreas" dargestellt. Der Chip-basierte Glukosesensor wurde als logische AND-Schaltung konzipiert, mit Glukose und Sauerstoff als Eingangssignale. Nur wenn beide Eingangssignale gleichzeitig vorhanden sind, kommt es zur Reaktion und ein Strom wird generiert. Dieser Strom kann dann zur Adressierung des impedimetrischen Sensors genutzt werden, auf dem ein temperaturabhängiges Hydrogel immobilisiert ist. Dieses Hydrogel dient, auf Grund seiner Quell- und Schrumpf-Eigenschaft, als Aktuator und kann somit zwischen "AUF" und "ZU" schalten. Damit kann eine bestimmte Menge eines Medikamentes (z.B. Insulin) freigesetzt werden. Um das Hydrogel auf seine Aktuatorfunktion zu prüfen, wurde die Impedanz bei verschiedenen Temperaturen (28 °C – 42 °C) untersucht. Im Gegensatz zur konventionellen "künstlichen Pankreas", wird bei dem BioLogicChip die Freisetzung des Wirkstoffs durch den Aktuator zusätzlich sensorisch überprüft. Hierbei dient ein Chip-basierter IrxOy-Sensor zur Insulinmessung. Als zweites Konzept wurde ein digitaler Adrenalinbiosensor entwickelt, mit dem Adrenalinkonzentrationsunterschiede zwischen Nebennierenblut und peripherem Blut gemessen werden sollen, um so die Position des Katheters während der Nebennierenvenen-katheteruntersuchung (AVS) zu überprüfen. Zur Entwicklung des Adrenalinbiosensors wurde ein Sauerstoffsensor mit einer 2-Enzymmembran, bestehend aus Laccase und Pyrroloquinolinchinon-abhängiger Glukose-Dehydrogenase (PQQ-GDH) modifiziert. Damit findet das Substraterecycling-Prinzip Anwendung, wodurch das Sensorsignal verstärkt wird. Im ersten Reaktionsschritt wird Adrenalin mit Hilfe der Laccase unter Sauerstoffverbrauch zu Adrenochrom oxidiert. Anschließend wird das entstandene Adrenochrom wieder über die PQQ-GDH zurück zu Adrenalin reduziert, bei gleichzeitiger Oxidation von Glukose. Der verbrauchte Sauerstoff wird mittels O2-Sensor gemessen und ist proportional zur Adrenalinkonzentration. Mit dem Adrenalinsensor konnte in Puffer- und Ringerlösung eine untere Nachweisgrenze von 1 nM bei pH 7,4 und 30 °C erreicht werden. Außerdem wurde die Querempfindlichkeit gegenüber anderen Katecholaminen (Noradrenalin, Dopamin, Dobutamin) überprüft. Zusätzlich konnten gespikte Adrenalinproben (1 nM – 150 nM) im Blutplasma untersucht werden. Außerdem wurden mit dem digitalen Adrenalinsensor "Proof-of-principle"-Experimente aus zwei aufeinanderfolgenden logischen AND-Schaltungen durchgeführt (Laccase als erste logische AND-Schaltung; PQQ-GDH als zweite logische AND-Schaltung). Mit diesem digitalen Adrenalinbiosensor kann eine schnelle, qualitative Analyse über die Adrenalinkonzentration im Blut erfolgen; der Arzt kann die Position des Katheters überprüfen und gegebenenfalls korrigieren. Im weiteren Verlauf wurde der Adrenalinbiosensor hinsichtlich seiner Miniaturisierbarkeit weiterentwickelt. Dazu wurde ein Chip-basierter Platinsensor mit dem Enzym PQQ-GDH modifiziert, um das bioelektrokatalytische Messprinzip zu ermöglichen, um so Adrenalin zu recyclen und das Sensorsignal zu verstärken. Der Chip-basierte Adrenalinbiosensor wurde bezüglich pH-, Temperatur- und Glukose-Optimum charakterisiert. Dabei konnte eine untere Nachweisgrenze von 1 nM bei einem physiologischen pH-Wert von pH 7,4, bei 30 °C und bei einer Glukosekonzentration von 20 mM erreicht werden. Darüber hinaus wurde die Langzeitstabilität des Biosensors über zehn Tage untersucht. Zusätzlich wurde die Sensitivität des Chip-basierten Biosensors gegenüber verschiedener Katecholaminen (Noradrenalin, Dopamin und Dobutamine) validiert. Die höchste Empfindlichkeit wurde bei Messungen mit Adrenalin erreicht. Es konnten erfolgreich erste Messungen in Blutplasma durchgeführt werden. Mit dem entwickelten Adrenalinbiosensor konnte außerdem die Konzentrationsdifferenz zwischen Nebennierenblut und peripherem Blut gemessen werden. Neben logischen Schaltungen mit amperometrischen Sensoren, wurden auch logische Schaltungen mit Feldeffekt-Sensoren am Beispiel eines Acetoinbiosensors entwickelt. Dieser soll für die Bestimmung verschiedener Acetoinkonzentrationen (z.B. in der Fermentation von Bier und Wein) eingesetzt werden. Der Feldeffekt-Sensor wurde mit Hilfe des Enzyms Acetoinreduktase modifiziert, wodurch rakemisches Acetoin zu (R,R)-2,3-Butandiol und Meso-Butandiol katalytisch umgesetzt wird. Bei dieser Reaktion werden H+-Ionen verbraucht. Der entwickelte Sensor zeigt ein lineares Verhalten bei Acetoinkonzentrationen zwischen 3 mM und 90 mM. Die höchste Sensitivität des Acetoinbiosensors konnte bei pH 7,1 erreicht werden. Es wurde die Langzeitstabilität über fünf Tage überprüft. Darüber hinaus wurden gespikte Acetoinkonzentrationen in Weißwein gemessen. Zukünftig könnte der Sensor als digitaler Acetoin/Diacecyl-Biosensor weiterentwickelt werden, da beide Substanzen zum Geschmack von Bier/Wein beitragen. Boole`sche JA/NEIN-Aussagen würden so den Status der Fermentation abbilden.


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