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Titel:Formstabile Peptidepitope für die personalisierte Diagnostik der rheumatoiden Arthritis
Autor:Schrimpf, Andreas
Weitere Beteiligte: Geyer, Armin (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2018
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2018/0099
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2018-00993
DOI: https://doi.org/10.17192/z2018.0099
DDC: Chemie
Titel(trans.):Shape-persistent peptide epitopes for the personalised diagnosis of rheumatoid arthritis
Publikationsdatum:2018-03-22
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
β-hairpin, Peptidepitope, NMR-basierte Strukturaufklärung, NMR-Spektroskopie, rheumat, Konformations-Aktivitäts-Beziehung, Konformation, hinge-Peptide

Zusammenfassung:
Die molekularen Grundlagen der Autoimmunität wurden mit Hilfe von Filaggrin-abgeleiteten β-hairpin-Peptiden erforscht. Als Modellerkrankung diente die rheumatoide Arthritis (RA), in deren Krankheitsverlauf sich eine Vielzahl von Autoantikörpersubtypen ausbildet. Es wurden Antworten auf die Frage gefunden, welche Eigenschaften Peptide besitzen müssen, um überhaupt als Epitope erkannt zu werden und somit die vorgenannten Subtypen zu binden und letztendlich zu unterscheiden. Die mittels Festphasensynthese hergestellten Peptidepitope eignen sich gleichzeitig als diagnostische Werkzeuge für die frühzeitige serologische Erkennung von RA. Ihr konformationeller Raum wurde systematisch durch korrelierte Einführung von β-hairpin-Designelementen (hydrophober Cluster, D-Aminosäuren, Disulfide, Deletionen etc.) variiert und mittels NMR-Spektroskopie in Lösung detailliert analysiert. Die daraus hervorgehenden, ungewöhnlichen Peptidstrukturen wurden in ELISA-Tests auf ihre biologische Aktivität gegenüber kommerziell erhältlichen RA-Autoantikörpern untersucht. Auf dieser Basis wurde eine Vorauswahl getroffen, um ein Set von zueinander komplementären Peptidantigenen (sowohl in Bezug auf ihre Konformation als auch auf ihre Antikörperaffinität) in weiterführenden Assays gegen Blutseren zu verwenden. Für jeden Patienten wurde so ein Barcode an gemessenen Absorptionen im ELISA erhalten, die je nach Kombination an absoluten und relativen Affinitäten der verwendeten Antigene zur (indirekten) Identifikation von Autoantikörper-Profilen führen. Diese ersten Tests liefern einen wichtigen Beitrag zu einer personalisierten Diagnostik der RA, wobei die angewendeten Methodiken auf andere Autoimmunerkrankungen und deren Epitop-Paratop-Paare übertragbar sind. Durch Deletion von Aminosäurepaaren der β-hairpin-Peptide wurden nicht nur hochaktive dimere Epitope erhalten, sondern es konnten auch Aussagen über die Periodizität dieser Sekundärstruktur gewonnen werden. Dabei wurde regioselektiv ein disulfidreiches (jede dritte Aminosäure des 12er-hairpins ist ein Cystein), antiparalleles hinge-Dimer (engl. hinge: Scharnier) mit vier Disulfidbrücken synthetisiert, das ohne den aufwendigen Einsatz von orthogonalen Schutzgruppen zuverlässig Homodimere ausbildet. Diese Peptidsequenz konnte in einem bottom up-Ansatz als Dimerisierungsdomäne in Proteine und Antikörper (letztere enthalten in ihrer natürlichen Form parallele hinge-Regionen) mittels rekombinanter Methoden eingebracht werden. Diese Arbeit liefert also entscheidende Beiträge zur Synthese und Strukturaufklärung von β-hairpin-Epitopen, zu deren systematischer Variation sowie deren Einsatz in der personalisierten Autoimmundiagnostik. Darüber hinaus wurden auf diese Weise verlässlich faltende Dimerisierungsdomänen für das de novo-Design von Proteinen erstellt.

Summary:
The molecular basis of autoimmunity was researched by utilising filaggrin derived β-hairpin peptides. Rheumatoid arthritis (RA) served as a role model. During its disease course, a wide variety of autoantibody subtypes emerges. In this context, answers to the question have been found, what actually makes a peptide an epitope, that is able to bind the aforementioned subtypes and ultimately distinguish them. Such peptide epitopes were synthesised via solid phase peptide synthesis and could be used as diagnostic tools for the early identification of rheumatoid arthritis (RA). Their conformational space was systematically varied by the correlated introduction of β-hairpin design elements (hydrophobic cluster, D-amino acids, disulfides, deletions etc.) and investigated in detail by NMR spectroscopy. The peptides’ diverse, unusual conformations and dynamics were then correlated with their biological activity against commercially available RA autoantibodies in ELISA tests. Based on these, a preselection of mutually complementary peptide antigens (regarding their conformation as well as their antibody affinities) were utilised in consecutive assays against blood sera. A barcode of measured absorptions in ELISA was thus obtained for every RA patient, which led to (indirect) identification of autoantibody profiles depending on the combinations of absolute and relative intensities among the employed antigens. These first tests deliver an important contribution towards a personalised RA diagnosis. At the same time, all applied methodologies can be transferred to other autoimmune diseases and their associated paratope-epitope-pairs. The deletion of amino acid pairs from the β-hairpin peptides did not only lead to highly affine epitopes, but also to valuable insights into the periodicity of this secondary structure. In this context, a disulfide-rich (every third amino acid of the 12mer hairpin constitutes a cysteine), antiparallel hinge peptide could be synthesised without elaborate protecting group chemistry. In a seminal bottom up approach, this biomolecule served as dimerisation domain in proteins and antibodies (the latter contain a parallel hinge region in their native state) by means of recombinatorial methods. This thesis provides a decisive contribution to the design, preparation and structural characterisation of β-hairpin peptide epitopes, their systematic and broadly applicable synthetic variation as well as their utilisation in autoimmune diagnostics. Beyond that, a reliably folding dimerisation domain has been created for the de novo design of proteins.


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