Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel: Herstellung und Charakterisierung tetraetherlipidhaltiger Lipoplexe und Lipopolyplexe als neuartige Vehikel für die orale Gentherapie
Autor: Engelhardt, Konrad
Weitere Beteiligte: Bakowsky, Udo (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2018/0096
DOI: https://doi.org/10.17192/z2018.0096
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2018-00962
DDC:
Titel(trans.): Preparation and characterization of tetraetherlipid containing lipoplexes and lipopolyplexes as novel vehicles for oral gene therapy
Publikationsdatum: 2018-03-13
Lizenz: https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Transfektion, Gentherapie, liposomes, toxicity, sulfolobus, Extraktion, Liposomen, gene therapy, transfection, Toxizität, Gentransfer, Lipoplexe, lipoplexes, Tetraetherlipide, extract, lipopolyplexes, gene transfer, tetraetherlipids, polyplexes, Lipopolyplexe, polymer, Polymer,Polyplexe, Sulfolobus

Zusammenfassung:
Die Gentherapie bietet ein großes Potential für die Behandlung von schweren chronischen Erkrankungen wie z.B. Krebs oder Erbkrankheiten. Hierbei werden nicht nur die Symptome der Krankheiten behandelt, sondern man versucht defekte Gene zu ersetzen. Mit sogenannten Genvektoren (viral oder nicht-viral) werden dabei Gene in menschliche Zellen eingeschleust. Ein Genvektor muss nicht nur eine hohe Transfektionseffizienz besitzen, sondern auch eine geringe Toxizität und hohe Patientencompliance aufweisen. Ein Gentherapeutikum zur oralen Anwendung, das eine hohe Stabilität gegenüber dem sauren pH-Wert im Magen hat, würde diese Kriterien am besten erfüllen. Ein vielversprechender Ansatz, um Genvektoren herzustellen, die in sauren pH-Werten stabil bleiben, stellt die Nutzung von Tetraetherlipiden der Archaeen dar. Archaeen bilden neben den Bakterien und Eukaryoten eine der drei Domänen zellulärer Lebewesen. Sie sind an extreme Milieubedingungen angepasst, z.B. wachsen sie bevorzugt bei +80 °C (hyperthermophil), in stark konzentrierten Salzlösungen (halophil) oder bei niedrigen pH-Werten (acidophil). Der Grund für diese außergewöhnliche Stabilität liegt darin, dass die Zellmembran der Archaeen aus Tetraetherlipiden aufgebaut ist. Im Gegensatz zu eukaryotischen Membranlipiden besitzen Tetraetherlipide keine Ester- sondern Etherbindungen. Des Weiteren durchspannen Tetraetherlipide die Membran vollständig und ordnen sich nicht zu einer Doppelmembran an. In der vorliegenden Arbeit wurden Tetraetherlipide aus den gefriergetrockneten Biomassen von Archaeen mittels Soxhlet-Extraktion extrahiert. Eine darauffolgende Aufreinigung fand an einer Kieselgelsäule statt. Die extrahierten Lipidfraktionen beschränkten sich auf TEL (Rohlipide), PLFE (polare Lipidfraktion E), hGDNT (hydrolysiertes Glycerol-Di-Alkyl-Nonitol-Tetraetherlipid) und hGDGT (hydrolysiertes Glycerol-Di-Glycerol-Tetraetherlipid). Zudem wurde ein neuartiges Tetraetherlipid (MI-0907) mit positiv geladener Kopfgruppe synthetisiert. Alle fünf Tetraetherlipide erhielt man als dunkelbraune bzw. hellgelbe waxartige Massen mit Ausbeuten von 1,9 - 46,89 % (bezogen auf die Ausgangsmasse). Für die Herstellung von Liposomen wurden Tetraetherlipide und konventionelle Lipide wie z.B. DPPC (1,2-Di-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin), CH (Cholesterol) oder DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammoniumpropan) in verschiedenen molaren Verhältnissen in einem organischen Lösungsmittel miteinander gemischt. Durch Verdampfung des ii Lösungsmittels bildete sich ein dünner Lipidfilm, der durch Zugabe einer wässrigen Pufferlösung in eine liposomale Suspension überführt wurde. Die so hergestellten Liposomen zeigten Durchmesser von 101 - 351 nm und PDI-Werte von 0,2 - 0,4. Liposomen mit günstigen Parametern bzgl. Größe und PDI-Wert stellten die Formulierungen hGDNT/DPPC/DOTAP (20/55/25 mol/mol/mol), MI-0907/DPPC/CH (20/55/25 mol/mol/mol) und hGDNT/DPPC/CH (20/55/25 mol/mol/mol) dar. Sie wurden in weiteren Experimenten in Pufferlösungen mit pH-Werten von 2 - 9 inkubiert und bzgl. der Änderung des Durchmessers nach einem Scoring System (--- bis +++) bewertet. Die oben genannten Formulierungen zeigten minimale Veränderungen bzgl. der Durchmesser und PDI-Werte. Die Komplexierung der positiv geladenen Formulierungen mit pDNA führte zu Lipoplexen, die ebenfalls eine hohe Stabilität bei pH-Werten von 2 - 9 zeigten. Die Transfektionseffizienzen der Formulierungen lagen ca. 30 - 40 % unter den Referenzsubstanzen (25kDa-bPEI oder DOTAP). Zur Verbesserung der Transfektionseffizienzen, bildete man Komposite aus Liposomen, Polymer und pDNA, sogenannte Lipopolyplexe. Als Liposomen wurden die oben genannten Formulierungen eingesetzt. Die Transfektionseffizienz lag bei Lipopolyplexen bis zu 50 % über den Referenzsubstanzen. Zudem wiesen Lipopolyplexe in Toxizitätsversuchen wie z.B. LDH-Assay eine um ca. 75 % reduzierte Toxizität im Vergleich zu einfachen Polyplexen auf. Die besondere Stabilität der tetraetherlipidhaltigen Lipopolyplexe wurde in einem Heparin-Assay ermittelt, wobei der Stabilitätseffekt deutlich höher war als für einfache Polyplexe. Die morphologischen Besonderheiten von Lipoplexen konnte mittels Rasterkraftmikroskopie untersucht werden. Hierbei war zu erkennen, dass sich pDNA um Liposomen windet und der Aufbau multilamellar erfolgt, d.h. mehrere Lipidschichten sind übereinander angeordnet und bilden einen „zwiebelartigen“ Aufbau der Komplexe. Bei Lipopolyplexen, die Durchmesser von 138 nm bis 156 nm annehmen, ist ein Polyplexkern von einer ca. 4 nm dicken Lipidschicht ummantelt. Die erfolgreiche Extraktion und Aufreinigung von Tetraetherlipiden aus Archaeen, ist für die Herstellung von Genvektoren eine wichtige Grundlage. Qualitätsbestimmende Kriterien der gewonnenen Lipoplexe und Lipopolyplexe wie reduzierte Toxizität, Stabilität im sauren pH-Milieu und erhöhte Transfektionseffizienz legen nahe, dass sich Genvektoren auf der Basis von Tetraetherlipiden der Archaeen für die orale Gentherapie eignen sollten.

Summary:
Gene therapy offers great potential for the treatment of severe chronic diseases such as cancer or hereditary diseases. It not only treats the symptoms of the disease, but also attempts to replace defective genes. Genes are introduced into human cells using so-called gene vectors (viral or non-viral). The structural and functional requirements for a suitable gene vector are manifold. It must not only have a high transfection efficiency, but also a low cell toxicity and high patient compliance. A gene therapeutical medicine for the oral application, which has a high stability against the acidic pH value in the stomach, would meet these criteria. A promising approach to produce gene vectors that remain stable under acidic pH conditions is the use of tetraether lipids from the archaea. Archaea form one of the three domains of cellular organisms, along with bacteria and eukaryotes. They are adapted to extreme environmental conditions, e. g. they grow preferably at +80 °C (hyperthermophil), in highly concentrated salt solutions (halophilic) or at low pH-values (acidophil). The reason for this extraordinary stability is that the cell membrane of the archaea is composed of tetraether lipids. In contrast to eukaryotic membrane lipids, tetraether lipids do not contain ester but ether bonds. Furthermore, tetraether lipids span the entire cell membrane and do not arrange themselves into a bilayer membrane. In the present work, tetraether lipids were extracted from the freeze-dried bio masses of archaea using soxhlet extraction. A subsequent purification was performed on a silica column. The lipid fractions extracted were limited to TEL (raw lipids), PLFE (polar lipid fraction E), hGDNT (hydrolyzed glycerol-di-alkyl-nonitol tetraether lipid) and hGDGT (hydrolyzed glycerol-di-glycerol tetraether lipid). In addition, a novel tetraether lipid (MI-0907) with a positively charged head groups was synthesized. All five tetraether lipids were obtained as dark brown or pale yellow wax-like masses with yields of 1.9 - 46.89 % (referring to the initial mass). For the preparation of liposomes, tetraether lipids and conventional lipids like DPPC (1,2-di-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), CH (cholesterol) or DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniumpropane) were mixed in different molar ratios in an organic solvent. Evaporation of the solvent produced a thin lipid film, which then was hydrated with an aqueous buffer solution resulting in a liposomal suspension. The liposomes prepared in this way showed diameters of 101 - 351 nm and PDI values of iv 0.2 - 0.4. Liposomes with favourable parameters regarding size and PDI-value provided the formulations hGDNT/DPPC/DOTAP (20/55/25 mol/mol/mol), MI-0907/DPPC/CH (20/55/25 mol/mol/mol) and hGDNT/DPPC/CH (20/55/25 mol/mol/mol). They were incubated in buffer solutions in further experiments with pH-values ranging from 2 - 9 and were evaluated with regard to the change of the diameter according to a scoring system (--- to +++). The liposomal formulations showed minimal changes in diameter and PDI values. The complexation of the positively charged formulations with pDNA led to lipoplexes, which also showed high stability at pH values of 2 - 9. The transfection efficiencies of the formulations were approximately 30 - 40 % below the reference substances like 25kDa-bPEI or DOTAP. In order to improve the transfection efficiencies, liposomes, polymers and pDNA composites, so-called lipopolyplexes, were prepared. The above mentioned formulations were used as liposomes, which had a high pH stability. The transfection efficiency of lipopolyplexes was up to 50 % above the reference substances. In addition, lipopolyplexes in toxicity tests such as LDH assay showed a reduced toxicity of about 75 % compared to simple polyplexes. The special stability of the tetraether lipid-containing lipopolyplexes was determined in a heparin assay, whereby the stability effect was higher than for simple polyplexes. The morphological characteristics of tetraether lipid-containing lipoplexes could be investigated by atomic force microscopy. It was found that pDNA is wrapped around liposomes and the structure is multilamellar, i. e. several lipid layers are arranged on top of each other and form a typical "onion-like" structure of the complexes. Lipopolyplexes, which have diameters of 138 nm to 156 nm, have an additional lipid layer of approx. 4 nm thickness. The successful extraction and purification of tetraether lipids from archaea is an important basis for the preparation of gene vectors. Quality-determining criteria of the lipoplexes and lipopolyplexes obtained, such as reduced toxicity, stability in the acidic pH environment and increased transfection efficiency suggest that gene vectors based on archaeal tetraether lipids should be suitable for oral gene therapy.


* Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten