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Titel: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Mutterkornalkaloiden in Ascomyceten
Autor: Gerhards, Nina
Weitere Beteiligte: Li, Shu-Ming (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0779
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-07796
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0779
DDC: 615 Pharmacology & therapeutics, prescription drugs
Titel(trans.): Molecular biological and biochemical investigations of the biosynthesis of ergot alkaloids in ascomycetes
Publikationsdatum: 2019-01-15
Lizenz: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Biosynthese, Mutterkornalkaloid

Zusammenfassung:
Mutterkornalkaloide sind basische Naturstoffe, die zu der Gruppe der Indolalkaloide gehören. Sie zeigen ein breites Spektrum an pharmakologischen und zuweilen auch toxischen Wirkungen aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu den Neurotransmittern Dopamin, Serotonin und Adrenalin. Die Hauptproduzenten sind filamentöse Pilze aus den Familien Clavicipitaceae und Aspergillaceae wie z.B. Claviceps purpurea, Aspergillus fumigatus oder Penicillium commune. Die ersten Schritte der Biosynthese von Mutterkornalkaloiden, ausgehend von L-Tryptophan, verlaufen bis zur Stufe von Chanoclavin-I Aldehyd in allen bekannten Produzenten gleich. Später verzweigen sich die Biosynthesewege und es entstehen unterschiedliche Endprodukte. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der letzte, noch nicht aufgeklärte, gemeinsame Schritt der Biosynthese untersucht werden: die Umwandlung von 4-DMA-L-Abrin zu Chanoclavin-I. Diese Reaktion untergliedert sich in mindestens zwei Oxidations- und einen Decarboxylierungsschritt. Deletions-Experimente haben gezeigt, dass die FAD-abhängige Oxidoreduktase FgaOx1 und die Katalase FgaCat für die Bildung von Chanoclavin-I essenziell sind. Um den Reaktionsmechanismus aufzuklären, sollten beide Enzyme in E. coli oder S. cerevisiae überproduziert und biochemisch charakterisiert werden. Im Falle von fgaCat war die heterologe Expression in E. coli erfolgreich, es konnte jedoch für dieses Enzym alleine keine katalytische Aktivität festgestellt werden. Die Sequenz von FgaOx1 aus der NCBI-Datenbank wurde durch eine Analyse der Intron-Exon-Struktur korrigiert, eine Überproduktion des Proteins in E. coli oder S. cerevisiae konnte jedoch nicht erreicht werden. Durch einen bioinformatischen Vergleich der Mutterkornalkaloid-Gene aus Aspergillus fumigatus, Claviceps purpurea und Arthroderma benhamiae mit den verfügbaren Genomsequenzen der Ascomyceten aus der NCBI-Datenbank konnten 15 weitere Spezies identifiziert werden, die die genetische Ausstattung für die Produktion von Mutterkornalkaloiden besitzen. Dazu zählen auch die beiden Pilze Penicillium roqueforti und Penicillium camemberti, die aufgrund ihrer industriellen Verwendung in der Käseherstellung bekannt sind. Im Rahmen der bioinformatischen Analysen wurden neben der Sequenz von FgaOx1 aus Aspergillus fumigatus auch die Proteinsequenzen von 27 weiteren Proteinen aus der NCBI-Datenbank durch Analyse der Intron-Exon-Struktur korrigiert. Durch die Identifizierung der Gencluster und die Korrektur der Sequenzen leistet diese Arbeit einen wertvollen Beitrag für die zukünftige Aufklärung der Biosynthesewege und die Analyse der strukturellen Vielfalt der Mutterkornalkaloide in den verschiedenen Produzenten. In der Vergangenheit wurde bereits über die Produktion von Isofumigaclavin A in Penicillium roqueforti berichtet, allerdings gab es zu Beginn dieser Arbeit keine Publikationen, die Aufschluss über die Biosynthese dieser Substanz geben. Durch die Identifizierung von zwei Mutternkornalkaloid-Genclustern und zwei weiteren, nicht geclusterten Genen in unterschiedlichen Bereichen des Genoms wurde der Grundstein für die Aufklärung des Biosyntheseweges gelegt. In dieser Arbeit wurden acht Gene, die möglicherweise für die späteren Schritte der Biosynthese von Isofumigaclavin A verantwortlich sind, ausgewählt und für die heterologe Expression in E. coli und S. cerevisiae kloniert. Drei der Gene konnten erfolgreich in E. coli exprimiert werden und die entsprechenden Proteine (FgaDHPr, FgaOx3Pr3 und FgaATPr) wurden mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Für FgaATPr konnte in den durchgeführten in vitro-Assays keine enzymatische Aktivität nachgewiesen werden. FgaDHPr wurde als kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase charakterisiert, welche die Umwandlung von Chanoclavin-I zu Chanoclavin-I Aldehyd in Anwesenheit von NAD+ katalysieren kann. In der aktiven Form liegt das Enzym vermutlich als Pentamer vor. Der KM-Wert für Chanoclavin-I lag bei 573 μM und für NAD+ bei 82 μM. Die mittlere maximale Reaktionsgeschwindigkeit vmax betrug 326 nmol mg-1 min-1 und die Wechselzahl kcat 0,15 s-1. FgaOx3Pr3 gehört zur Gruppe der „Old Yellow Enzymes“ und fungiert als FMN-enthaltende und NAD(P)H-abhängige Oxidoreduktase. Im Rahmen der durchgeführten Enzym-Assays wurde FgaOx3Pr3 als Chanoclavin-I Aldehyd-Reduktase charakterisiert, die zusammen mit FgaFS aus Aspergillus fumigatus oder EasG aus Claviceps purpurea die Bildung von Festuclavin katalysieren kann. Des Weiteren wird in Anwesenheit von FgaOx3Pr3 die Aktivität der untersuchten Chanoclavin-I Dehydrogenasen (FgaDH, ChaDH, FgaDHPr und FgaDHPca) signifikant gesteigert. Es konnte mit Hilfe der durchgeführten Experimente nachgewiesen werden, dass die Aktivitätssteigerung auf eine Aufhebung der Produkthemmung der FgaDH-Reaktion durch FgaOx3Pr3 zurückzuführen ist. Da diese Fähigkeit noch für kein anderes Enzym dieser Klasse beschrieben wurde, handelt es sich bei FgaOx3Pr3 um ein einzigartiges, bifunktionales Enzym, das ein exzellenter Kandidat für die chemoenzymatische Synthese von Mutterkornalkaloiden des Clavin-Typs ist. Über die Produktion von Mutterkornalkaloiden in Penicillium camemberti wurde bisher nicht in der Literatur berichtet. Auch in dieser Arbeit konnten in den Kulturextrakten der untersuchten Stämme keine Mutterkornalkaloide nachgewiesen werden, obwohl ein potenzielles Gencluster für deren Biosynthese identifiziert wurde. Die beiden Gene fgaDHPca und easHPca wurden für die heterologe Expression in E. coli und S. cerevisiae kloniert und konnten in beiden Organismen erfolgreich überproduziert werden. Für EasHPca konnte keine enzymatische Aktivität nachgewiesen werden. FgaDHPca wurde jedoch wie FgaDHPr ebenfalls als Chanoclavin-I Dehydrogenase charakterisiert, welche in ihrer aktiven Form als Tetramer vorliegt. Die ermittelten KM-Werte lagen bei 536 μM für Chanoclavin-I und 528 μM für NAD+. Die mittlere maximale Reaktionsgeschwindigkeit vmax betrug 383 nmol mg-1 min-1 und die Wechselzahl kcat 0,18 s-1. In dieser Arbeit wurde somit erstmals bewiesen, dass P. camemberti die genetische Ausstattung für die Biosynthese von Mutterkornalkaloiden besitzt.

Summary:
Ergot alkaloids are alkaline natural products that belong to the group of indole alkaloids. They have a broad spectrum of pharmacological, but often toxic effects because of their structural similarity with the neurotransmitters dopamine, serotonin and adrenaline. The main producers are filamentous fungi of the families Clavicipitaceae and Aspergillaceae like Claviceps purpurea, Aspergillus fumigatus or Penicillium commune. Starting with L-tryptophan, the first steps of the biosynthesis of ergot alkaloids are similar in all known producing species. After reaching the branch point of the biosynthetic pathways, different end products are formed. This study aims to investigate the remaining common step of the biosynthesis of ergot alkaloids: the conversion of 4-DMA-L-abrine to chanoclavine-I. This step includes at least two oxidation and one decarboxylation reactions. Deletion studies showed that the FAD dependent oxidoreductase FgaOx1 and the catalase FgaCat are essential for the formation of chanoclavine-I. To elucidate the reaction mechanism, both enzymes should be overproduced in E. coli or S. cerevisiae and characterized biochemically. In the case of fgaCat, the heterologous expression in E. coli was successful, but no catalytic activity could be detected for this enzyme alone. The sequence of FgaOx1 from the NCBI database was corrected after an analysis of the intron-exon-structure, but the overproduction of the protein in E. coli or S. cerevisiae was not successful. A bioinformatic comparison of the ergot alkaloid genes from Aspergillus fumigatus, Claviceps purpurea and Arthroderma benhamiae with available genome sequences of Ascomycetes from the NCBI database revealed the presence of ergot alkaloid genes in 15 species that had not been described before. Two of those species are Penicillium roqueforti and Penicillium camemberti which are known for their usage in the industrial production of cheese. In addition to FgaOx1, another 27 protein sequences from the NCBI database were corrected after analysis of their intron-exon-structures in the course of the bioinformatic studies. By identifying the gene clusters and correcting the sequences, this work is a valuable contribution to the future elucidation of the biosynthetic pathways and the analysis of the structural diversity of ergot alkaloids in various producing species. The production of isofumigaclavine A in Penicillium roqueforti has been reported previously, but there were no publications about its biosynthesis at the beginning of this study. The identification of two ergot alkaloid gene clusters and two additional non-clustered genes in different genomic regions laid the foundation for the elucidation of the biosynthetic pathway. Eight genes are very likely involved in the later steps of the isofumigaclavine A biosynthesis and were chosen for cloning and heterologous expression in E. coli and S. cerevisiae. Three of these genes were successfully expressed in E. coli and the recombinant proteins (FgaDHPr, FgaOx3Pr3 and FgaATPr) were purified via affinity chromatography. The in vitro assays showed no enzymatic activity for FgaATPr. FgaDHPr was characterized as a short-chain dehydrogenase/reductase which catalyzes the conversion of chanoclavine-I to chanoclavine-I aldehyde in the presence of NAD+. The native form of the enzyme is likely a pentamer. The KM value for chanoclavine-I was 573 μM and for NAD+ 82 μM. The mean maximum reaction velocity vmax was 326 nmol mg-1 min-1, corresponding to a turnover number kcat 0.15 s-1. FgaOx3Pr3 belongs to the “Old Yellow Enzymes“ and acts as a FMN containing and NAD(P)H dependent oxidoreductase. FgaOx3Pr3 was characterized as a chanoclavine-I aldehyde reductase which catalyzes the formation of festuclavine in the presence of FgaFS from Aspergillus fumigatus or EasG from Claviceps purpurea in vitro. In addition, the enzyme activities of all investigated chanoclavine-I dehydrogenases (FgaDH, ChaDH, FgaDHPr and FgaDHPca) were enhanced significantly by FgaOx3Pr3. These experiments proved that FgaOx3Pr3 overcomes the product inhibition for the FgaDH reaction, resulting in an enhanced product yield. This feature has not been described for other enzymes of the same class, therefore FgaOx3Pr3 is a unique bifunctional enzyme and an excellent candidate for the chemoenzymatic synthesis of clavine-type ergot alkaloids. The production of ergot alkaloids in Penicillium camemberti has not been reported in the literature so far. Although a potential gene cluster for the biosynthesis of ergot alkaloids has been identified in this study, no ergot alkaloids were detected in the culture extracts of the investigated strains. Nevertheless, the two genes fgaDHPca and easHPca were cloned and successfully expressed in E. coli and S. cerevisiae. EasHPca showed no enzymatic activities in the in vitro assays, while FgaDHPca was characterized as a chanoclavine-I dehydrogenase. The native Form of FgaDHPca is likely a tetramer and the KM values were 536 μM for chanoclavine-I and 528 μM for NAD+. The mean maximum reaction velocity vmax was 383 nmol mg-1 min-1 and the turnover number kcat 0.18 s-1.Thus, it was shown for the first time in this work, that P. camemberti has the genetic potential for the biosynthesis of ergot alkaloids.


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