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Titel: Exporling the Evolvability of Old Yellow Enzymes for Organic Synthesis
Autor: Nett, Nathalie
Weitere Beteiligte: Hoebenreich, Sabrina (Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0773
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0773
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-07731
DDC: Chemie
Titel(trans.): Erforschung der Evolvierbarkeit von En-Reduktasen für die Organische Synthese
Publikationsdatum: 2019-01-15
Lizenz: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Hydrierung, Protein Engineering, asymmetric hydrogenation, Biokatalyse, Proteindesign, Mutagenese, Old Yellow Enzymes, Enreductase

Summary:
In the presented thesis, guidelines for the evolution of flavin-dependent ene reductases, an in-dustrially important catalyst class, are reported. In the first part of this thesis it should be tested if mining the existing knowledge of the Old Yellow Enzyme family (OYE), obtained from directed evolution studies, may allow guided traversing through the sequence space and thereby shortcutting biocatalyst development. Iden-tified hotspot positions of YqjM from Bacillus subtilis, i.e. C26D/I69T and C26G for improvement of activity and stereoselectivity, respectively, were transferred to seven OYE scaffolds. The new-ly created variants were tested with three compounds revealing more stereocomplementary OYE pairs with potent turnover frequencies (up to 660 h-1) and excellent stereoselectivities (up to >99%). Although systematic prediction of absolute enantioselectivity still remains for OYE variants, ‘scaffold sampling’ was confirmed as a fast engineering method for this family allow-ing access to new, potent biocatalysts for organic synthesis. In the second part of this thesis the development and characterisation of an engineered panel of ene reductases (ERs) from Thermus scotoductus SA-01 (TsER) is reported, that combines control over facial selectivity in the reduction of electron deficient carbon-carbon double bonds with thermostability (up to 70 °C), organic solvent tolerance (up to 40% (v/v)) and a broad substrate scope (23 compounds, three of them new). The panel shows excellent enantiomeric excess (ee) and yields during gram scale synthesis (3.8 g). Exquisite turnover frequencies (TOF) up to 40 000 h-1 are achieved, which are comparable to rates in hetero- and homogeneous metal cata-lysed hydrogenations. Efforts to rationalize the stereocomplementarity are reported, using the obtained crystal structure of TsER C25D/I67T and in silico docking studies. Our holistic charac-terisation, together with the preparative scale reactions, shows that these engineered ERs are truly practical catalysts for preparative organic synthesis. In the third section the aforementioned panel of TsER variants was screened for bulkier sub-strate classes and further mutation sites were identified over semi-rational design for the suc-cessful biotransformation of coumarin-like structures. Thereby chemoselective variants with either hydrogenation or evidence for acid/base catalysis in the active site of TsER have been discovered. In general there is a great interest in using these highly selective trans-hydrogenation catalysts in the late stage synthesis of complex organic molecules.

Zusammenfassung:
In der vorliegenden Arbeit werden Leitlinien zur Evolution flavinabhängiger Enreduktasen, eine industriell wichtige Katalysatorklasse, dargelegt. Die erarbeiteten Konzepte und Richtlinien, die allgemeingültig für diese Enzymfamilie und deren Substrate sind, könnten in zukünftigen protein-engineering-Projekten zu einer erheblichen Effizienzsteigerung führen. Der erste Teil dieser Dissertation beschäftigt sich mit einer konzeptuellen Fragestellung zur Vereinfachung von potein-engineering Studien. Im Speziellen wurden die bereits vorhandenen Kenntnisse über einzelne Enreduktasen, der Old Yellow Enyzme (OYE) Familie, die von gerichteten Evolutionsstudien herrühren, herangezogen, um diese auf den gesamten Sequenzbereich der Enzymfamilie zu übertragen. Dadurch soll die Weiterentwicklung neuer effizienterer Enreduktasen verkürzt werden. Identifizierte hotspot Positionen, wie C26D/I69T und C26G, in der Bindetasche von YqjM aus Bacillus subtilis, die für eine Aktivitätserhöhung und Stereokomplementarität verantwortlich sind, wurden in sieben weitere OYE Familienmitglieder eingebaut. Die ersten Screenings dieser neu synthetisierten Varianten mit drei unterschiedlichen Substraten zeigten jeweils stereokomplementäre Paare mit hohen Wechselzahlen von bis zu 660 h-1 und exzellenten Stereoselektivitäten bis zu >99%. Obwohl die systematische Vorhersage der absoluten Enantioselektivität für OYE-Varianten sich weiterhin als schwierig erweist, wurde die Methode des „scaffold samplings“ als schnelles Engineering-Verfahren für diese Familie bestätigt, die den Zugang zu neuen, potenten Biokatalysatoren für die organische Synthese ermöglicht. Der Fokus des zweiten Teils der Arbeit liegt auf der Entwicklung und Charakterisierung industriell interessanter Varianten der thermostabilen Enreduktase aus Thermus scotoductus SA-01 (TsER). Diese Varianten zeigen hohe Aktivitäten und Selektivitäten in industriell interessanten Prozessparametern, wie Temperaturen bis zu 70 °C, organische Lösungsmittelzusätzen von bis zu 40% (v/v) und präparative Ansätze, mit Produktisolationen von 3.8 g. Die erreichten Wechselzahlen von bis zu 40 000 h-1 sind mit denen der hetero- und homogenen Katalyse von Hydrierungen vergleichbar. Um strukturelle Einblicke in die stereoselektive Hydrierung von TsER zu erlangen, wurden in silico Studien anhand der Kristallstrukturen des Wildtyps und der Varianten C25D/I67T, C25G/I67T und C25D/I67T/A102H durchgeführt. Die umfassende Charakterisierung dieser Sammlung an thermostabilen Enreduktasen zeigt ein hohes Potential für den Einsatz in der organischen Synthese. Im dritten Teil dieser Arbeit wird das Substratspektrum auf strukturell anspruchsvollere Substanzen erweitert, im Speziellen die Klasse der Cumarine. Im Allgemeinen besteht ein großes Interesse darin den Substratbereich von Enreduktasen auf sperrige Substrate zu erweitern, um diese hochselektiven Transhydrierungskatalysatoren in einem späten Stadium der organischen Synthese komplexer Moleküle zu verwenden. Dabei wurden chemoselektive Varianten entdeckt, die zum Einen die bekannte Hydrierung katalysieren aber zum Anderen auch eine Säure/Base Aktivität in der aktiven Tasche von TsER aufweisen, wodurch das Hydrolyse Produkt des Lactones entsteht.


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