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Titel: Structure-function analysis of Cmu1, the secreted chorismate mutase from Ustilago maydis
Autor: Han, Xiaowei
Weitere Beteiligte: Kahmann, Regine (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0770
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0770
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-07705
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Strukturfunktionsanalyse von Cmu1, der sekretierten U. maydis Chorismatmutase
Publikationsdatum: 2018-06-26
Lizenz: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Dokument

Schlagwörter:
Ustilago zeae, Maisbeulenbrand, Ustilago maydis

Summary:
The basidiomycete fungus Ustilago maydis is the causative agent for smut disease of maize (Zea mays). More than 400 putative secreted proteins are encoded in the genome of U. maydis. The secreted chorismate mutase Cmu1 of U. maydis is such a translocated virulence promoting effector. The chorismate mutase activity of Cmu1 in the cytosol is proposed to lower the chorismate levels in the chloroplast where it would serve as precursor for the biosynthesis of the plant defense hormone salicylic acid (SA). The crystal structure of Cmu1 revealed several unique features in comparison to the cytoplasmic chorismate mutase Aro7p of Saccharomyces cerevisiae, including a surface exposed acidic patch, a disulfide bond, a putative fatty acid binding site and a loop region. This thesis shows, that site-directed mutagenesis affecting the acidic patch, the disulfide bond and the fatty acid binding site results in functional mutant proteins that can complement the virulence phenotype of CL13Δcmu1 strains. Wildtype Cmu1 protein purified after heterologous expression in E. coli followed a Michaelis-Menten kinetic in a chorismase mutase activity assay. Mutations in the fatty acid binding site did not alter the observed kinetic. A U. maydis triple mutant of cmu1, the isochorismatase coding gene um12021 and shy1 encoding a salicylate hydroxylase was reduced in virulence compared to any single or double mutants, suggesting an interplay of three U. maydis enzymes in suppressing SA pathway. By performing immunoprecipitation (IP) of Cmu1 from infected leave tissues followed by mass spectrometry, the maize protein Cmi1 (Cmu1 interactor 1) could be identified as an interactor. In vitro pull-down experiments confirmed the interaction between Cmu1 and Cmi1. Recombinant Cmi1 inhibited the chorismate mutase activity of Cmu1. The expression of cmi1 is strongly induced upon the infection of U. maydis, indicating that it is likely a pathogenesis related (PR) protein. Hydrogen-Deuterium exchange mass spectrometry (HDX/MS) mapped the interaction interface between Cmu1 and Cmi1, which involved the loop region of Cmu1. Truncation of the loop in Cmu1, which abolished the interaction of Cmu1 with Cmi1, showed only partial complementation of CL13Δcmu1 mutants, suggesting that the interaction between Cmu1 and Cmi1 may be relevant for the virulence of U. maydis.

Zusammenfassung:
Der Brandpilz Ustilago maydis gehört zu den Basidiomyceten und ist Erreger des Maisbeulenbrandes in Zea mays. Das U. maydis Genom kodiert für mehr als 400 sekretierte Effektoren Proteine. Die sekretierte U. maydis Chorismatmutase Cmu1 ist solch ein translozier Effektor. Dem Modell zufolge soll die Chorismatmutase Aktivität von Cmu1 im pflanzlichen Zytoplasma dazu führen, dass die Chorismatkonzentration in den Chloroplasten, wo Chorismat zur Synthese des pflanzlichen Abwehrhormons Salizylat (SA) herangezogen würde, gesenkt wird. Die Cmu1 Kristallstruktur zeigt, dass dieser Effektor im Vergleich zur zytoplasmatischen Chorismatmutase Aro7p von Saccharomyces cerevisiae besondere Merkmale besitzt: einen exponierten Bereich aus sauren Aminosäuren, eine Disulfidbrücke, eine putative Fettsäurebindestelle und eine Loop-Region. Diese Arbeit zeigt, dass durch zielgerichtete Mutagenese der sauren Oberflächenregion, der Disulfidbrücke und der putativen Fettsäurebindestelle funktionellen Proteine erzeugt wurden, die den Virulenzphänotyp des U. maydis Stammes CL13Δcmu1 komplementieren konnten. Nach Überexpression in E. coli gereinigtes Cmu1 Protein folgte in einem Chorismatmutase Aktivitätstest einer Michaelis-Menten Kinetik. Die Mutation der Fettsäurebindestelle hatte keinen Einfluss auf die Enzymkinetik von Cmu1. Ein U. maydis Dreifachdeletionsstamm, in welchem cmu1, das für die Isochorismatase codierende Gen um12021 und shy1, welches für eine Salizylat Hydroxylase codiert deletiert wurden, zeigte, im Gegensatz zu Stämmen in welchen diese Gene einzeln oder paarweise deletiert wurden, reduzierte Virulenz. Dies deutet darauf hin, dass diese drei Enzyme bei der Unterdrückung des SA Weges zusammenwirken. Durch Immunopräzipitation (IP) von Cmu1 aus infiziertem Gewebe und anschließender massenspektroskopischer Analyse konnte das Mais Protein Cmi1 (Cmu1 interactor 1) als Interaktionspartner identifiziert werden. Diese Interaktion konnte durch in vitro Pull-down Experimente bestätigt werden. Rekombinantes Cmi1 Protein inhibierte die Chorismatmutase Aktivität von Cmu1. Die Expression von cmi1 wird nach Infektion mit U. maydis stark hochreguliert, was für einen Zusammenhang zwischen Cmi1-Funktion und Pathogenität spricht. Mittels Wasserstoff-Deuterium-Austauschmessungen (HDX/MS) konnte die Loop-Region in Cmu1 als Interaktionsbereich identifiziert werden. Ein cmu1 Allel mit verkürzter Loop-Region, wodurch die Interaktion zwischen Cmu1 und Cmi1 unterbunden wurde, konnte den Virulenzdefekt von CL13Δcmu1 nur teilweise komplementieren. Dies könnte deutet darauf hindeuten, dass die Interaktion zwischen Cmu1 und Cmi1 für die Virulenz von U. maydis von Bedeutung ist.


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