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Titel: Der Einfluss von N6-Methyladenosin auf die Replikation von Influenzaviren
Autor: Laukemper, Viktoria
Weitere Beteiligte: Bauer, Stefan (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0752
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0752
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-07529
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): The influence of N6-methyladenosine on the replication of influenza viruses
Publikationsdatum: 2017-12-14
Lizenz: https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:

Zusammenfassung:
RNA-Moleküle verschiedenster Organismen enthalten zahlreiche chemisch modifizierte Nukleoside, deren Funktionen bisher nur zum Teil verstanden sind. In eukaryotischer mRNA ist N6-Methyladenosin (m6A) die am häufigsten vorkommende Modifikation und entsteht durch die Methylierung der Aminogruppe an Position 6 des Ringsystems. Diese wird durch einen Enzymkomplex aus METTL3, METTL14 und WTAP innerhalb der Konsensussequenz [G/A/T][G>A]m6AC[T>A>C] vermittelt. Die Sequenzabfolge GGACT ist dabei das am häufigsten methylierte Motiv. Verschiedene Studien deuten darauf hin, dass m6A verschiedene Schritte des RNA-Metabolismus beeinflusst und damit zahlreiche zelluläre Prozesse regulieren kann. Hierbei wird insbesondere ein Einfluss von m6A auf die Translation, das Spleißen und die Stabilität von RNA diskutiert. Die Effekte von m6A werden in der Zelle durch Bindung verschiedener reader-Proteine aus der hnRNP- und YTH-Proteinfamilie vermittelt. Interessanterweise enthält auch die mRNA verschiedener Viren m6A, aber die Funktion dieser Modifikation für die Virusreplikation und Pathogenese sind noch zu einem großen Teil unverstanden. Ältere Studien deuten darauf hin, dass auch die mRNA von Influenzaviren m6A enthält, wobei die genauen Positionen der Methylierungen nicht bekannt sind. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von m6A auf die Replikation des Influenzastammes A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 untersucht. Dafür wurden rekombinanten Viren hergestellt, die Mutationen in den m6A-Konsensusmotiven GGACT der viralen NS-, NA- oder HA-mRNA enthielten, sodass an diesen Positionen keine Methylierung mehr stattfinden konnte, gleichzeitig jedoch keine Veränderung der Aminosäuresequenz induziert wurde. Durch Replikationsversuche und Untersuchung der Protein- sowie mRNA-Expression in humanen Zelllinien wurden die Viren charakterisiert und mit Wildtyp(wt)-Viren verglichen. Dabei zeigte sich, dass die Viren mit den mutierten GGACT-Motiven in der HA-mRNA deutlich schlechter replizierten als die wt-Viren und zudem eine reduzierte Expression der HA-mRNA- sowie des HA-Proteins zeigten. Die Mutationen in den GGACT-Motiven der NS- und NA-mRNA hatten hingegen keinen Einfluss auf die Virusreplikation. Um die Beobachtungen aus den Replikationsversuchen auf den Methylierungsstatus der Viren zurückführen zu können, wurden die m6A-Positionen in der mRNA des wt-Virus und des Virus mit den Mutationen in der HA-mRNA mithilfe der Methode des methylated RNA immunoprecipitation with next generation sequencing (MeRIP-Seq) identifiziert. So konnte gezeigt werden, dass die GGACT-Motive der NS- und NA-mRNA des wt-Virus nicht methyliert vorlagen, was die normale Replikationsfähigkeit der entsprechenden Virusmutanten erklärte. Von den GGACT-Motiven in der HA-mRNA des wt-Virus enthielt nur ein einziges eine m6A-Modifikation. Hierbei handelte es sich um das 2. GGACT-Motiv in der HA-mRNA. Diese Methylierung konnte in der mRNA des Virus, bei dem die GGACT-Motive in der HA-mRNA durch Mutationen verändert wurden, nicht mehr identifiziert werden. Replikationsversuche mit Viren, bei denen die GGACT-Motive der HA-mRNA nicht gleichzeitig, sondern einzeln mutiert vorlagen, konnten zeigen, dass die Mutation des 2. GGACT-Motivs zu einer reduzierten Replikationsfähigkeit und zu einer verringerten Expression der HA-mRNA- sowie des HA-Proteins führte. Die reduzierte Replikationsfähigkeit des Virus, welches Mutationen an allen GGACT-Motiven in der HA-mRNA aufwies, konnte damit allein auf die Mutation des 2. GGACT-Motivs und dem damit einhergehenden Verlust der m6A-Modifikation an dieser Position zurückgeführt werden. Durch das MeRIP-Seq konnten weitere m6A-Modifikationen in den mRNAs des NS-, M-, NA-, NP- und HA-Segments nachgewiesen werden, insbesondere in den 5‘- und 3‘-Regionen, deren Funktionen in weiteren Versuchen untersucht werden muss. Der Nachweis einer Influenza-vermittelten Regulation der m6A-assoziierten Proteine sollte Hinweise liefern, durch welche Mechanismen m6A die virale RNA- und Proteinexpression während einer Infektion beeinflusst. Eine Influenza-vermittelte Veränderung der mRNA-Expression von Demethylasen, Methyltransferasen und reader-Proteinen konnte in den verwendeten Zelllinien jedoch nicht gezeigt werden. Aufgrund bisheriger Studien, die auf eine YTHDF2-vermittelte Verstärkung der Proteintranslation von methylierter mRNA hindeuten, wurde auch die Proteinexpression von YTHDF2 in humanen Zellen während einer Influenzainfektion untersucht. Auch hier zeigte sich jedoch keine Veränderung in der Expression. Weitere Versuche werden daher klären müssen, durch welche Mechanismen m6A in der Influenza-mRNA die Proteinexpression und Replikation beeinflusst. Zusammenfassend konnte damit in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der Verlust einer m6A-Modifikation in der viralen mRNA zu einer reduzierten Replikationsfähigkeit der Influenzaviren führte. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Hemmung der m6A-Modifikation in der Zelle die Replikation der Influenzaviren einschränken könnte und damit das Potential für einen neuen Therapieansatz gegen die Influenzagrippe bietet.

Summary:
RNA from different organisms contains more than 100 different chemically modified nucleosides, but their functions are largely unknown. N6-methyladenosine (m6A) is the most abundant modification in eukaryotic mRNA and is post-transcriptionally installed by a methyltransferase complex consisting of METTL3, METTL14 and WTAP within the consensus motif [G/A/T][G>A]m6AC[T>A>C]. Therefore, the sequence motif GGACT is the most common m6A motif. M6A is bound by proteins from the YTH and hnRNP protein family, which function as reader proteins and regulate cellular processes like translation, splicing and RNA decay. Interestingly, viral mRNA has also been reported to contain m6A but the role for virus replication and pathogenicity still has to be elucidated. Studies from the 1970s indicate that influenza virus mRNA also contains m6A but the exact positions of m6A have not yet been determined. In this thesis, the influence of m6A on the replication of the influenza strain A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 was analyzed. For this purpose, recombinant viruses were generated which contain mutations in the m6A consensus motifs GGACT of the viral NS, NA or HA mRNAs. These mutations will abrogate the N6-methylation at the respective position without inducing a change in the amino acid sequence of the protein. The viruses were characterized by replication experiments and analysis of the viral RNA and protein expression, and then compared to the wt virus. It could be shown that the virus with the mutated GGACT motifs in the HA mRNA (HAmut1-4) replicated less efficient when compared to the wt virus and showed a reduced HA mRNA and HA protein expression. In contrast, the mutations in the GGACT motifs of the NS and NA mRNA did not affect viral replication. To link the observations from the replication studies to the methylation status of the viruses, the m6A positions in the mRNA from the wt virus and from the virus HAmut1-4 were determined by the method of methylated RNA immunoprecipitation with next generation sequencing (MeRIP-Seq). This analysis showed that the GGACT motifs in the NS and NA mRNA of the wt virus were not methylated and therefore confirmed the results from the replication studies, in which the viruses with mutations at these sites replicated normally. In the HA mRNA, only one of the four GGACT sites was methylated. The mRNA from the wt virus contained a methylation at the second GGACT motif, which was abrogated in the mRNA from the virus HAmut1-4 with the mutated GGACT motifs. In further experiments recombinant influenza viruses were generated in which the GGACT motifs in the HA mRNA were mutated individually. Replication studies with these viruses could show that the mutation of the second GGACT motif lead to a reduced replication efficiency and to a decreased expression of HA mRNA and HA protein. Therefore, the reduced replication efficiency of the virus HAmut1-4 with four mutated GGACT motifs in the HA-mRNA could be linked solely to the single mutation at the second GGACT motif and to a resulting loss of m6A at this position. The MeRIP-Seq could determine further m6A modifications in the NA, M, NA, NP and HA mRNA, especially in the 5’ and 3’ regions. Further studies have to elucidate the functions of these m6A modifications. The detection of an influenza-mediated regulation of the m6A-associated enzymes should reveal how m6A regulates viral mRNA and protein expression during an influenza infection. In this thesis, however, an influenza-mediated change in the mRNA expression of different methyltransferases, demethylases and reader proteins could not be shown. With regard to different studies, which indicate a role of YTHDF2 in the m6A-mediated increase of protein translation, the YTHDF2 protein expression was also analyzed during an influenza infection in human cell lines. However, the virus infection did not induce any visible change in the YTHDF2 protein expression. Therefore, further studies have to reveal how m6A influences the replication and protein expression of influenza viruses. In summary, this thesis could show that the loss of an m6A modification in the viral mRNA lead to a reduced replication efficiency of influenza virus. These data suggest that the inhibition of m6A modifications could have the potential to inhibit influenza replication and could therefore be used as a therapy against influenza infection.


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