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Titel: Functional characterization of the Ustilago maydis effector protein Ten1
Autor: Erchinger, Philipp
Weitere Beteiligte: Kahmann, Regine (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0707
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0707
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-07072
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Funktionelle Charakterisierung des Ustilago maydis Effektorproteins Ten1
Publikationsdatum: 2018-06-26
Lizenz: https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Ustilago maydis, Effektor

Summary:
Ustilago maydis, the causal agent of corn smut disease, is a pathogen that establishes a biotrophic interaction with Zea mays. The interaction with the host plant is largely governed by a plethora of secreted effector proteins, many of which are encoded in gene clusters. The deletion of cluster 10A consisting of 10 effector-encoding genes results in strongly reduced virulence after maize seedling infection. In the present study, the gene UMAG_03744 (termed ten1) could be identified as a major virulence factor of gene cluster 10A. Via quantitative reverse transcription PCR an induction of ten1 during the biotrophic development of the fungus was detected. ten1 deletion strains showed a virulence phenotype mainly reflected by a reduced tumor size on seedling leaves. Moreover, by complementing the cluster 10A deletion strain for ten1, the strong virulence defect of the cluster mutant was partially rescued. After overexpression in U. maydis hyphae, secreted Ten1 protein could be detected in axenic culture supernatant. Furthermore, using immunoelectron microscopy, the translocation of secreted Ten1 to plant cells could be shown after maize seedling infection, manifested by a significant accumulation of the protein in the plant cytoplasm and especially in plant nuclei. Through a yeast two-hybrid screen ZmPP26, a type 2C maize protein phosphatase (PP2C) could be identified as interaction partner of Ten1. This interaction was supported by coimmunoprecipitation experiments after transient co-expression of Ten1 and ZmPP26 in Nicotiana benthamiana. Moreover, ZmPP26 could be detected by mass spectrometry after immunoprecipitation of Ten1 from U. maydis-infected leaf tissue. Via yeast two-hybrid assays the ZmPP26-interacting domain of Ten1 was mapped. The engineered protein Ten1m, harboring amino acid substitutions in the interacting domain, showed no interaction with ZmPP26 in yeast two-hybrid assays. By complementing the cluster 10A deletion strain with Ten1m, the virulence defect of the cluster mutant could not be rescued, suggesting that the interaction of Ten1 and ZmPP26 may be biologically relevant.

Zusammenfassung:
Der Pilz Ustilago maydis ist der Erreger des Maisbeulenbrandes. Die biotrophe Interaktion mit der Wirtspflanze Mais wird hauptsächlich durch eine Vielzahl sekretierter Effektorproteine ermöglicht, die oftmals in Genclustern codiert werden. Die Deletion von Cluster 10A resultiert in einer stark verringerten Virulenz nach Infektion von Maissetzlingen. In der vorliegenden Arbeit konnte das Gen UMAG_03744 (umbenannt zu ten1) als wesentlicher Virulenzfaktor von Cluster 10A bestimmt werden. Mittels quantitativer Reverse-Transkriptase-PCR wurde eine Induzierung von ten1 während der biotrophen Entwicklung des Pilzes festgestellt. ten1 Deletionsmutanten zeigten einen Virulenzphänotyp, der sich überwiegend in einer Reduktion der Tumorgröße auf Blättern äußerte. Des Weiteren führte die Komplementation der Cluster 10A Deletionsmutante mit ten1 zu einer teilweisen Wiederherstellung der Virulenz. Nach Überexpression in Hyphen von U. maydis konnte sekretiertes Ten1 Protein im Überstand von axenischer Kultur detektiert werden. Darüber hinaus wurde, nach Infektion von Maispflanzen, sekretiertes Ten1 Protein in Pflanzenzellen mittels Immunelektronenmikroskopie nachgewiesen, wobei eine Akkumulation des Proteins im Zytoplasma und besonders in Zellkernen beobachtet werden konnte. Mittels Hefe-Zwei-Hybrid-System wurde ZmPP26, eine Typ 2C Protein-Phosphatase (PP2C) als Interaktionspartner von Ten1 identifiziert. Diese Interaktion konnte bestätigt werden durch Koimmunpräzipitation von Ten1 und ZmPP26 nach transienter Koexpression beider Proteine in Nicotiana benthamiana. Darüber hinaus wurde, nach Immunpräzipitation von Ten1 aus infiziertem Maispflanzenmaterial, ZmPP26 mittels Massenspektrometrie als Interaktor nachgewiesen. Durch Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen wurde die Interaktionsdomäne von Ten1 kartiert. Das modifizierte Protein Ten1m, das Aminosäureaustausche in der Interaktionsdomäne besitzt, zeigte keine Interaktion mit ZmPP26 in Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen. Die Komplementation der Cluster 10A Deletionsmutante mit Ten1m führte nicht zu einer Wiederherstellung der Virulenz, was dafür spricht, dass die Interaktion von Ten1 und ZmPP26 biologisch relevant sein könnte.


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