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Titel: Flavonolignan Biosynthesis in Silybum marianum – Potential Regulatory Mechanisms and Candidate Genes
Autor: Poppe, Lennart
Weitere Beteiligte: Petersen, Maike (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0674
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0674
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-06745
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Flavonolignan Biosynthese in Silybum marianum – Mögliche Regulationsmechanismen und Kandidatengene
Publikationsdatum: 2017-10-11
Lizenz: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Dokument

Schlagwörter:
chemotypes, Dirigierende Proteine, silymarin, Mariendistel, Flavonolignane, Phenylpropanstoffwechsel, Biosynthese, Silibinin, Kandidatengen, Peroxidase, In-vitro-Kultur, dirigent protein

Summary:
Silymarin, a flavonolignan mixture from milk thistle (Silybum marianum, Asteraceae), is mainly used for the supportive therapy of chronic liver diseases or to prevent toxic liver damage. In addition, beneficial effects for human health like tumor inhibition and immunomodulatory mechanisms have been reported. The plant produces and accumulates silymarin mainly in the testa and pericarp for protection of its sporophytic embryo against plant herbivores and to limit or prevent bacterial, fungal or viral infections. The final step in the biosynthetic pathway of silymarin is not yet fully elucidated. Starting point is the amino acid L-phenylalanine which is converted to 4-coumaroyl-CoA which is the essential precursor for flavonoids and monolignols. A flavonoid (taxifolin) and a monolignol (coniferyl alcohol) then are transformed to silymarin by radical formation (oxidation), coupling, rearrangement and subsequent cyclisation. Several positional isomers (mainly silychristin, silydianin, silybin and isosilybin) occur, the latter two being present as diastereomeric pairs. The distribution of these regioisomers differs in ecotypes/cultivars and genotypes. Whereas a peroxidase (POD) is probably responsible for the radical formation, very little is known about how the plant discriminates between its regioisomers and diastereomers. A potential involvement of dirigent proteins (DIRs), controlling the formation, has been investigated. In vitro cultures have been established from seedlings of three Silybum marianum varieties for further insights into flavonolignan content and composition in suspension cultures and the release of flavonolignans to the outer compartments. Additionally, over a period of two weeks, one culture line was characterised based on various medium parameters, silymarin formation and corresponding enzyme activities. The same culture line was also subjected to an elicitation attempt. However, despite a slight increase in the quantities of the specialised metabolites of the silymarin mixture, the amounts of flavonolignans produced in suspension cells of Silybum marianum are very low. Interestingly, a connection between the individual positional isomer amounts of silymarin extracted from the mature fruit skins and the respective in vitro cells could be determined. The regioisomer composition in suspension cells resembled the chemotype of the plant origin. This underlined the assumption of the existence of high genotypic variations and the possible presence of involved regulatory mechanisms. Higher taxifolin concentrations increased the formation of two specific regioisomers in enzyme assays but no further direct mechanism for discrimination could be found. Since enzyme activity and flavonolignans could also be detected in the medium of suspension cells, transport systems might play a role as well. A class III secretory peroxidase, a laccase of the cupredoxin superfamily and two different dirigent proteins could be identified to be a part of the gene pool of Silybum marianum. Unfortunately, the expression of these genes in different E. coli and yeast strains turned out to be a big hurdle. Signal peptides and several glycosylation sites, crucial for structure and activity, greatly contribute to this. Optimisation at some points would be necessary in order to yield recombinant proteins. On the other hand, the enzyme(s) involved in the coupling reaction between taxifolin and coniferyl alcohol could be extracted from in vitro cells and the respective medium. The radical-forming protein could successfully be identified as a peroxidase with a molecular weight of about 45 kDa using chromatographical methods. In general, structure and function should be similar to the versatile used horseradish peroxidase (HRP). However, this protein alone could not specifically regulate the formation of individual silymarin regioisomers. Even though dirigent proteins could be identified on the genomic level their presence in enzyme preparations or an actual involvement could never be proven. Their expression and utilisation could be plant organ- and/or time-specific, namely active only during the fruit development and maturation phase. In summary, in the scope of this thesis, enzymes probably involved in the final step of the silymarin biosynthesis and numerous factors possibly regulating the positional isomer ratios were discussed and highlighted. While issues concerning the expression of recombinant proteins remained to be challenging, reasonable solutions were presented. A continuation of this project seems promising and very interesting for further clarification of this subject.

Zusammenfassung:
Silymarin, ein Flavonolignangemisch aus der Mariendistel (Silybum marianum, Asteraceae), wird überwiegend zur unterstützenden Therapie von chron. Lebererkrankungen sowie zur Prävention tox. Leberschäden genutzt. Zusätzlich werden positive Effekte wie Tumorhemmung und immunmodulatorische Mechanismen beschrieben. Die Pflanze reichert Silymarin hauptsächlich in der Samenschale und Fruchtwand an. Dies dient zum Schutz des Keimlings gegen Pflanzenfresser und um Bakterien-, Pilz- oder Virusinfektionen einzudämmen oder zu verhindern. Der letzte Schritt im Biosyntheseweg von Silymarin ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Ausgangssubstrat ist die Aminosäure L-Phenylalanin, die zu 4-Cumaroyl-CoA umgewandelt wird, welches eine essentielle Vorstufe für die Synthese von Flavonoiden und Monolignolen ist. Ein Flavonoid (Taxifolin) und ein Monolignol (Coniferylalkohol) reagieren dann über Radikalbildung, Verknüpfung, Umlagerung und anschließendem Ringschluss zu Silymarin. Dabei entstehen mehrere Positionsisomere (hauptsächlich Silychristin, Silydianin, Silybin und Isosilybin), wobei die beiden zuletzt genannten als Diastereomerenpaare vorliegen. Die Verteilung der Regioisomere unterscheidet sich in Ökotypen/Kultursorten und Genotypen. Für die Radikalbildung ist sehr wahrscheinlich eine Peroxidase verantwortlich. Es ist nur sehr wenig darüber bekannt, wie die Differenzierung zwischen den Regioisomeren und Diastereomeren in der Pflanze abläuft, deshalb wurde eine mögliche Beteiligung von dirigierenden Proteinen untersucht. Aus Keimlingen dreier S. m. Varianten wurden in-vitro Kulturen angelegt, um zusätzliche Erkenntnisse über Gehalt und Zusammensetzung der Flavonolignane zu erhalten. Weiterhin wurde die Sekretion der Sekundärstoffe in Zellwand und Medium von Suspensionskulturen untersucht. Eine Kulturlinie wurde über einen zweiwöchigen Zeitraum in Bezug auf verschiedene Mediumskenngrößen, Silymarinbildung und entsprechende Enzymaktivitäten charakterisiert. Mit der gleichen Kulturlinie wurde auch eine Elicitierung durchgeführt. Obwohl eine geringe Zunahme an Silymarinkomponenten beobachtet werden konnte, sind die in Suspensionszellen von S. m. produzierten Mengen an Flavonolignanen leider sehr gering. Bemerkenswert dabei war ein Zusammenhang zwischen den einzelnen Positionsisomeren des Silymarins, extrahiert aus den reifen Fruchtschalen, und den entsprechenden in-vitro Kulturen. Die Zusammensetzung der Regioisomere in den Suspensionszellen hat Ähnlichkeit mit dem Chemotyp der Pflanzenherkunft. Dies untermauert die Annahme von genotypischen Variationen und eine mögliche Beteiligung regulatorischer Mechanismen. Erhöhte Taxifolinkonzentrationen in Enzymassays steigerten zwar die Bildung von zwei spezifischen Regioisomeren, weitere direkte Wege der Differenzierung konnten jedoch nicht gefunden werden. Da auch das Medium der Suspensionszellen Enzymaktivität und Flavonolignane aufwies, spielen vermutlich auch Transportsysteme eine Rolle. Durch molekularbiologische Methoden konnten eine sekretorische Peroxidase (Klasse III), eine Laccase der Cupredoxin-Familie und zwei dirigierende Proteine im Genpool von S. m. identifiziert werden. Die Expression dieser Gene in verschiedenen E. coli und Hefestämmen erwies sich leider als sehr schwierig. Diese Problematik wurde verstärkt durch die Anwesenheit von Signalpeptiden und mehreren Glykosylierungsstellen, welche wichtig für Aufbau und Funktion der Proteine sind. Für die Gewinnung rekombinanter Proteine wäre eine weitere Optimierung notwendig. Die an der Kopplungsreaktion zwischen Taxifolin und Coniferylalkohol beteiligen Enzyme konnten auch aus in-vitro Zellen und dem Medium gewonnen werden. Das verantwortliche Enzym konnte durch chromatographische Trennverfahren erfolgreich als Peroxidase mit einem Molekulargewicht von etwa 45 kDa bestimmt werden. Im Allgemeinen sollte sie in Struktur und Funktion der Meerrettich-Peroxidase (HRP) ähneln. Allerdings konnte dieses Protein allein nicht die Bildung einzelner Regioisomere des Silymarins gezielt steuern. Obwohl dirigierende Proteine auf genomischer Ebene nachgewiesen wurden, konnte ihre Gegenwart in Enzymextrakten oder ihre tatsächliche Beteiligung an der Bildung unterschiedlicher Silymarinkomponenten nicht belegt werden. Sie könnten organspezifisch oder zu verschiedenen Entwicklungstadien der Pflanze exprimiert werden. Eine Beteiligung nur während der Fruchtentwicklung und Reifungsphase wäre denkbar. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Rahmen dieser Arbeit Enzyme untersucht wurden, die vermutlich den letzten Schritt der Silymarin-Biosynthese katalysieren. Zahlreiche Faktoren wurden angesprochen, die möglicherweise die Zusammensetzung der Positionsisomere regulieren. Während die Expression der rekombinanten Proteine eine Herausforderung bleibt, wurden weitere Lösungsvorschläge vorgestellt. Eine Fortsetzung dieses Projektes scheint vielversprechend und hinsichtlich einer weiteren Aufklärung dieses Themas sehr interessant.


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