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Titel: Ribopyranosylierte Peptide als Bausteine für den reversiblen Aufbau von Bisubstrat-Inhibitoren für die Proteinkinase A
Autor: Kirschner, Romina Anna
Weitere Beteiligte: Geyer, Armin (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0669
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0669
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-06699
DDC: 540 Chemie
Titel(trans.): Ribopyranosylated peptides as building blocks for the reversible assembly of bisubstrate inhibitors for protein kinase A
Publikationsdatum: 2018-05-07
Lizenz: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Peptidsynthese Proteinkinase A Festphasenpeptidsynthese Strukturaufklärung Magnetische Kernresonanz Glykosylierung Bisubstrat-Inhibitoren Boron, Peptide synthesis Protein kinase A Solid phase peptide synthesis Structure determination Nuclear magnetic resonance Glycosylation Bisubstrate i, Peptidsynthese Proteinkinase A Festphasenpeptidsynthese Strukturaufklärung Magnetische Kernresonanz Glykosylierung

Zusammenfassung:
Die Entwicklung von Bisubstrat-Inhibitoren beinhaltet Aspekte der beiden Methoden der Fragment-basierten Wirkstoffsynthese und der Übergangszustand-analogen Inhibitor-Synthese. Zwei Fragmente, die z.B. über einen Linker miteinander verknüpft werden, ahmen die natürlichen Substrate und gleichzeitig die synthetischen Inhibitoren eines Enzyms nach und sollen durch die Doppeladressierung für mehr Wechselwirkungen mit diesem sorgen. Darüber hinaus bietet die dadurch erhoffte Steigerung der Selektivität für ein spezielles Enzym einen Vorteil gegenüber einfachen Inhibitoren, deren Spezifität sich nicht nur auf eine bestimmte Proteinkinase beschränken lässt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde neben der Entwicklung von Bisubstrat-Inhibitoren ein weiterer Aspekt in diesem Kontext erstrebt. So sollte trotz der Verfolgung einer höheren Selektivität der synthetisierten Bisubstrat-Inhibitoren über die Verwendung von kovalent reversibler Chemie die Übertragbarkeit auf andere Kinasen erleichtert werden, da häufig sehr große Ähnlichkeiten zwischen den Inhibitoren verschiedener Kinasen bestehen. Daraus resultierend wurde auf eine Verknüpfung des Substrats mit dem Inhibitor im Vorfeld verzichtet, sondern auf ein „Finden“ während der Kristallisation, aufgrund der räumlichen Nähe im Protein und der Affinität der beiden Komponenten zueinander, aufgebaut. Es sollte demnach festgestellt werden, ob der entropische Gewinn des freiwerdenden Wassers im Zuge der reversiblen Bindungsknüpfung zwischen dem Diol und der Boronsäure dafür sorgt, dass eine Veresterung in wässriger Umgebung stattfinden kann. Bevor jedoch Kristallisationsansätze und Affinitäts-Tests mit solchen Bisubstrat-Inhibitoren durchgeführt werden konnten, welche in Kooperation mit dem AK Klebe aus der pharmazeutischen Chemie stattfanden, mussten brauchbare Bausteine für die Verknüpfung beider Komponenten synthetisiert werden. Dies geschah in Anlehnung an computerbasierten Berechnungen unter Zuhilfenahme bereits vorhandener Kristallstrukturen der PKA. Zunächst erfolgte die Synthese verschiedener ribopyranosylierter Aminosäure Bausteine, indem Aminosäuren mit Hydroxy- und Thiol-Funktionen in der Seitenkette über unterschiedliche, Lewis-Säure vermittelte Glykosylierungsreaktionen mit der Tetraacetyl-geschützten Ribopyranose umgesetzt wurden (RAS). Dabei konnten insgesamt sieben verschiedene RAS-Bausteine in z. T. guten Ausbeuten erhalten werden. Die Ausbeuten der jeweiligen Synthesen lagen bei allen Bausteinen in einem Bereich, der es ermöglichte, diese sowohl in der manuellen als auch in der automatisierten Festphasenpeptidsynthese einzusetzen. Die Übertragbarkeit des Einbaus der RAS-Bausteine von kurzen Test-Sequenzen auf größere Peptide war problemlos möglich, sodass mehrere PKI-Sequenzen, mit RAS-Mutationen an verschiedenen Stellen in der Nähe des aktiven Zentrums, synthetisiert werden konnten. Für die Synthese des Inhibitors wurde die Struktur des Fasudils® als Leitmotiv gewählt, da dieses bereits als Inhibitor mit einem KD-Wert im nanomolaren Bereich bekannt ist. Daher wurden zunächst vereinfachte Sulfonamid-Bausteine synthetisiert, um die generelle Verknüpfbarkeit mit Boronsäuren zu untersuchen. Beginnend mit einem System, bei welchem die Verknüpfung des Inhibitors mit der Formylphenylboronsäure über dessen Iminierung mit einem freien Amin stattfand, wurde letztlich auf eine stabilere Verknüpfung der beiden Komponenten umgestiegen, die auf der reduktiven Aminierung der Formylphenylboronsäure mit den entsprechenden primären und sekundären Aminen beruhte. Somit konnte auch die zweite Komponente in verschiedenen Ausführungen erfolgreich synthetisiert werden, sodass anschließend die Veresterung der Zuckerbausteine mit der Boronsäure erfolgen konnte. Diese Verknüpfung wurde im Vorfeld testweise mit jedem RAS-Baustein (in Form eines entsprechenden Tetrapeptids) mit Pyrenboronsäure im NMR-Maßstab in DMSOd6 durchgeführt, sodass aufgrund der geringeren Komplexität der aufgenommenen NMR-Spektren genaue Studien zum Bindungsmodus und der Stabilität mit den jeweiligen RAS-Bausteinen angestellt werden konnten. Schließlich erfolgte die Übertragung der Verknüpfungsexperimente auf das Bisubstrat-Inhibitor-System der PKA im wässrigen Puffer, durch welche sich Kristallstrukturen erhofft wurden, in denen eine erfolgte Veresterung zu beobachten wäre. Tatsächlich jedoch wurden Kristallstrukturen erhalten, in denen keine Verknüpfung zu sehen war, da die Abstände beider Komponenten zueinander zu groß waren (siehe PDB-Codes: unveröffentlichte Dissertation Janis Müller). Ähnliche Ergebnisse wurden für die Experimente mit dem Fasudil zweiter Generation erhalten. Anhand der Kristallstrukturen konnte bestätigt werden, dass in Protein-Umgebung keine Verknüpfung der Zucker-Komponente mit dem Boronsäure-modifizierten Inhibitor stattgefunden hat, da sich die entsprechenden, für die Veresterung benötigten funktionellen Gruppen nicht nah genug kommen und wahrscheinlich auch das umgebende Protein die Beweglichkeit der beiden Komponenten beeinträchtigt. Somit bedarf es der weiteren Optimierung des Systems, wobei das größere Potential im Boronsäure-Baustein zu finden sein dürfte, da dieser mehr Möglichkeiten für eine Modifizierung bereithält. Ein Wechsel der Ribose gegen einen anderen Zucker im Aminosäure-Baustein käme ebenfalls in Frage (Versuche mit Fructose wurden durchgeführt), jedoch wäre mit Auswirkungen auf die allgemeine Syntheseroute zu rechnen, da eventuell andere Schutzgruppen am Zucker und der Aminosäure oder andere Glykosylierungs-Methoden von Nöten wären. Generell konnte jedoch gezeigt werden, dass die PKI-Sequenz die Mutation mit einem RAS-Baustein an vielen Positionen relativ gut toleriert, da die erhaltenen KD-Werte nicht für einem völligen Verlust der Affinität sprechen (außer bei PKI). Zu diesem Zeitpunkt waren jedoch die Kristallisationsversuche und Affinitätsmessungen noch nicht vollständig abgeschlossen, sodass noch einige Ergebnisse ausstehen. In weiterführenden Arbeiten müsste das System kompatibel für eine Umsetzung im wässrigen Milieu gemacht werden, da zwar die Reaktivität in DMSOd6 sehr hoch ist, in Wasser jedoch mit den verwendeten Komponenten nicht bestätigt werden konnte. Da jedoch eine Verknüpfung im Protein und somit in Puffer bzw. Wasser gewünscht ist, muss eine Optimierung der beiden Verknüpfungs-Komponenten erfolgen, die eine Übertragung der Reaktion in das wässrige System ermöglicht. Dies macht jedoch den Wechsel zu einem anderen Zucker unumgänglich, da in zahlreichen Experimenten gezeigt werden konnte, dass die pyranoide Form der Ribose in Wasser keine Umsetzung mit Boronsäuren zeigt, selbst bei Verwendung des, ausschließlich in Wasser reagierenden, Benzoboroxols. Weiterhin wurden auch andere Peptidsequenzen auf ihre Toleranz gegenüber RAS-Bausteinen getestet und ein Versuch gestartet, über den gleichzeitigen Einbau von Boronsäure und RAS-Baustein in ein Peptid eine intramolekulare Zyklisierung hervorzurufen. Der β-hairpin des Foldons zum Beispiel tolerierte die RbS-Mutationen sehr gut, da sowohl die einfache, als auch die doppelte RbS-Einbindung hohe Werte für die relative Faltungspopulation lieferten. Auch die Filaggrin Peptide mit Mutationen der beiden Serine gegen RbS bzw. des Threonins gegen RbT konnten mittels ELISA-Test positiv auf ihre Affinität gegenüber Autoantikörper rheumatoider Arthritis getestet werden. Die Versuche zur intramolekularen Zyklisierung über verschiedene Boronsäuren mit dem RbS-Baustein in diversen Heptapeptiden bzw. letztlich im β-hairpin des Foldons zeigten alle eine gewünschte Umsetzung zum zyklischen Produkt, jedoch konnte zumeist kein vollständiger Umsatz beobachtet werden. Generell erscheint die Methode jedoch geeignet, eine intramolekulare Zyklisierung in Peptiden einzuleiten. Ein ähnlicher Ansatz beinhaltete die Bildung von Makromolekülen über die Verknüpfung von Peptiden, von denen eines eine Boronsäure enthält und ein weiteres einen RAS-Baustein. Das getestete System, bestehend aus einem Ausschnitt aus der Aβ-Sequenz von Prionen-Peptiden (mit einer gekuppelten Boronsäure an die Seitenkette eines Lysins) und einem Ausschnitt aus der PKI-Sequenz (mit RbS Mutation), lieferte ebenfalls die gewünschte Verknüpfung, was mittels NMR Spektroskopie gezeigt werden konnte. Somit gelang der Zusammenschluss zweier Peptide zu einem Peptid mit einem Molekulargewicht > 3000 g/mol schlichtweg durch das Vereinen beider Peptide in einem NMR-Röhrchen in DMSOd6. Beide letztgenannten Methoden bergen noch viel Potential für die Synthese zyklischer Peptide und die Generierung von Makromolekülen, da der Einbau der benötigten Verknüpfungskomponenten während der Festphasenpeptidsynthese sehr leicht handhabbar ist und es sich bei der stattfindenden Veresterung um ein generell reversibles Verknüpfungssystem handelt. Ein weiteres verfolgtes Projekt war die Synthese von Phenylalanin-Derivaten mittels Miyaura-Borylierung über die Verwendung von Arylboronsäure-Verbindungen. Dabei konnten zwei Aminosäure Bausteine (4-Iod-Phenylalanin und 4,4‘-Biphenylalanin) erfolgreich synthetisiert und zunächst in den β-hairpin des Foldons und anschließend in die Foldon-Sequenz integriert werden. Anschließende NMR-spektroskopische Untersuchungen ergaben z. T. eine gesteigerte Stabilität der β-hairpin Struktur verglichen mit der nativen Sequenz, sodass auch auf diesem Gebiet Potential für weitere Experimente mit den genannten Aminosäure Bausteinen zu finden ist.

Summary:
The development of bisubstrate inhibitors covers the aspect of the methods of fragment-based drug design as well as the transition state analog inhibitor synthesis. Two fragments, which are e. g. connected by a linker, simultaneously mimicking the natural substrates or inhibitors of an enzyme to increase the interactions by double addressing of both binding sites. Furthermore the intended increase of selectivity for a certain enzyme by using bisubstrate inhibitors has the advantage of a more specific binding to a certain protein kinase compared to the use of easier inhibitors. In this study, the development of such bisubstrate inhibitors was one aspect that was taken care of. Another aspect with opposing intentions concerning the increase of selectivity of the inhibitor was the use of covalent reversible chemistry for the linkage of both substrates/inhibitors to give the chance of transferability to other kinases, because inhibitors for different kinases usually bear huge similarities among each other. As a result the linkage between the substrate and the inhibitor was not incorporated in advance but they were intended to “find each other” during crystallization approach through their sterical proximity and affinity reasons. It was thought to find out, if the entropical gain caused by the release of water during the reaction of the diol and the boronic acid can overcome the unfavored esterification under aqueous conditions. Prior to performing crystallization approaches and affinity tests with these bisubstrate inhibitors in the pharmaceutical department in the working group of Prof. Klebe, suitable building blocks that form the linkage between them, had to be synthesized. This was done in dependence on the computer based calculations with the aid of already measured crystal structures of PKA. First the syntheses of different ribopyranosylated amino acid building blocks were performed by using amino acids bearing several hydroxy- and thiol-functions in the side chain as well as tetraacetyl protected ribopyranose, putting them together through lewis acid mediated glycosylation reactions. In this manner a total of six different RAA building blocks with partially good yields have been synthesized. The yields received in the respective syntheses were all providing enough product to be able to use it in manual as well as in automatic solid phase synthesis. Furthermore the transfer of the conditions used for the RAA-incorporation into short test-peptides to larger peptides was easily manageable, so several PKI peptides bearing RAA mutations at different positions near the active side were synthesized. For the synthesis of the inhibitor, Fasudil® was being used as chemical lead because of known KD-values for this inhibitor in a nanomolar range. Therefore simplified sulfonamide building blocks were initially synthesized to study their general ability for being linked to boronic acids. Beginning with a system where the linkage of the inhibitor was performed with the aldehyde function in formylphenylboronic acid via its imination with a free amine, the reaction was switched to another one providing a more stable linkage. Henceforth the linkage was being introduced by the reductive amination of formylphenylboronic acid with the corresponding primary or secondary amine. With this the second building block - the “borono-fasudil” with different variations was successfully finished and available for esterification reactions with the sugar building blocks. The linkage tendency with boronic acids was tested with each RAA building block in advance (using the corresponding tetrapeptides) using pyrenboronic acid on a NMR scale in DMSOd6. This was done to receive NMR spectra with lower complexity enabling detailed studies of the binding mode and the stability of each RAA building block linked to boronic acid. Finally the transfer of the linkage-experiments to the bisubstrate-inhibitor-system of the PKA in aqueous buffer was arranged, hoping for the formation of crystals to observe the esterification product. As a matter of fact crystal structures were received, which did not show the desired linkage but a distance between both components that could not be overcome by esterification (PDB-Codes: see unpublished dissertation Janis Müller). Similar results were obtained with the experiments with “borono-fasudil” of the second generation. The obtained crystal structures confirmed that no linkage between the sugar component and the boronic acid-modified inhibitor in the protein environment took place, because the participating functional groups are too far away from each other and the surrounding protein additionally decreases the mobility of both components. Consequently the examined system needs to be optimized, where the boronic acid component would be the more promising starting point as it holds more options for modification. A change of the ribose residue in the amino acid building block against another sugar would also be possible (experiments using fructose were performed) but would probably have a major impact on the general synthesis. Other protecting groups for the sugar moiety and the amino acids might become necessary or even a change of the glycosylation method. What basically could be proven is the tolerance of PKI sequences for mutations with RAA building blocks at different positions, which could be indicated by the obtained KD-values that still covered proper affinity ranges (except from PKI). At this time the crystallization approaches and affinity measurements had not been completely finished, therefore some results were still outstanding. Further studies would require the transfer of the whole system to aqueous conditions. While the reactivity in DMSOd6 was assigned to be quite high, no reactivity could be seen for the esterification in water. Since the desired linkage has to be performed inside the protein and water/buffer respectively, the described system needs optimization of both components to that effect that a transfer of the reaction into an aqueous system is possible. Therefore the ribose moiety inevitably has to be changed to another sugar, because it was shown in numerous experiments that the pyranoide conformer of ribose does not react with boronic acids in water, even though benzoboroxols were used, which exceptionally react in water. Moreover the tolerance of other peptide sequences referring to RAA building blocks were tested and experiments were initiated for the simultaneous incorporation of boronic acids and RAA building blocks into the same peptide for reasons of inducing intramolecular cyclisation. For example the β-hairpin of the foldon peptide showed a high tolerance for the incorporation of one as well as of two RbS-mutations into the peptide chain, which was indicated by high values for the folding population for both mutated peptides. Furthermore the filaggrin peptides having RbS mutations at both serine positions as well as the one with a RbT mutation at the threonine position showed positive results concerning their affinity towards autoantibodies of rheumatoid arthritis, which was observed with ELISA tests. The approach of intramolecular cyclisation reactions using different boronic acids with RbS building blocks in various heptapeptides and finally in β-hairpin peptides all showed the desired conversion leading to the cyclized products, but mostly with incomplete conversions. Generally spoken this method seems to be suitable to induce the intramolecular cyclisation in peptides. A similar approach covers the formation of macromolecules via the linkage of different peptides to each other. Therefore one of the peptides has to bear a boronic acid and another one a RAA building block. The tested system in this study consisted of a cutout of the Aβ sequence of prion peptides (with boronic acid coupled to side chain of lysine) and a cutout of the PKI sequence (with RbS mutation), which also gave the desired linkage, proven by NMR spectroscopy. In this way the combination of two different peptides was accomplished providing a peptide with a molecular weight of > 3000 g/mol just by combining two peptides in a NMR tube in DMSOd6. Both last-mentioned methods contain plenty of potential for the synthesis of cyclic peptides and the formation of macromolecules, because of the easily feasible incorporation of the linking-components into the corresponding peptides during SPPS and the reversibility of the esterification reaction. Another tracked project was the synthesis of phenylalanine derivatives via the Miyaura-borylation using aryl boronic acid compounds. In doing so two amino acid building blocks (4-iodo phenylalanine and 4,4’-bisphenylalanine) were successfully synthesized and were incorporated into the β-hairpin of the foldon and afterwards into the foldon sequence. The following NMR spectroscopic analysis partly showed an increased stability for the β-hairpin structure compared to the native sequence, which gave this topic a lot of potential for further investigations on the incorporation of such amino acid building blocks into the foldon peptide.

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