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Titel:Genomic Analysis of Secondary Metabolism in U. maydis
Autor:Reyes Fernández, Esmeralda
Weitere Beteiligte: Bölker, Michael (Prof. Dr)
Veröffentlicht:2016
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0663
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-06637
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0663
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Genomische Analyse des Sekundärmetabolismus in Ustilago maydis
Publikationsdatum:2018-04-05
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
Secondary metabolism, Ustilago maydis, Melanin, Sekundärmetabolismus, Polyketidsynthasen, Ustilago maydis, Polyketide Synthases, Ustilago maydis, Polyketidsynthasen, Melanin, Sekundärmetabolismus, Melanin

Summary:
Summary Ustilago maydis is a well established model organism for the study of plant-microbe interactions although its biosynthetic potential has not been totally explored. Therefore, in this work we focused our attention on identifying potential secondary metabolite (SM) gene clusters by mining U. maydis genome. The combination of different strategies as manual annotation and bioinformatic approaches allowed us the detection of 4 potential SM gene clusters (A-D). The further selection of cluster A as a subject of this study, was based on its chromosomal location and the analysis of gene expression profiles among members of each cluster. Such analysis was possible due to the construction of an excel table in which all available U. maydis gene expression data from Gene Expression Omnibus were compiled and normalized. Overexpression of the transcription factor Mtf1 in cluster A resulted in the activation of at least 12 genes including three polyketide synthases (pks3, pks4 and pks5), a cytochrome P450 (cyp4) and a versicolorin B synthase (vbs1), among others. Prolonged induction of cluster A triggered the production of a black-greenish pigment mainly composed of 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene (T4HN), therefore cluster A was named as the melanin-like cluster. This result showed that U. maydis synthesizes melanin using an unusual pathway, since most fungal melanins are derived from DHN, whose precursor is T4HN. Mutants defective for pks3, pks4, pks5 and cyp4 did not accumulate melanin, indicating a crucial role of these genes at the first stages of its biosynthesis. Deletion of cyp4 produced orsellinic acid (OA) and two of its derivatives. Interestingly, a feeding experiment with OA rescued the melanization defect of pks3 and pks4 deletion mutants. Moreover, the simultaneous expression of the pks3 and pks4 genes produced OA, suggesting that both genes are involved in OA biosynthesis, which is then used as a substrate for further chemical conversion into T4HN, a reaction presumably catalyzed by Cyp4 and/or Pks5. Overexpression of pks1, a polyketide synthase gene in U. maydis previously reported to play a role in melanization together with pks2 and lac1, could rescue the phenotype in the strain MB215 pks3 Pcrg::mtf1, suggesting that Pks3 and Pks1 have complementary functions. Maize seedlings infected with single deletion mutants of the melanin-like cluster genes showed no effect on spore coloration and had only a minor effect on virulence, supporting the previous finding that pks1 and pks2 are the major contributors of melanization during sporulation. On the other hand, SG200 pks3, SG200 pks4 and SG200 pks5 showed no significant differences compared to the wild type (SG200) when exposed to hydrogen peroxide, indicating that melanin-like cluster genes may be involved in other kind of stress responses, hence further experiments need to be performed to understand the conditions under which the melanin-like cluster is activated.

Zusammenfassung:
Zusammenfassung Obwohl Ustilago maydis ein gut etablierter Modellorganismus zur Erforschung von Interaktionen zwischen Pflanzen und Mikroben ist, ist sein biosynthetisches Potenzial nur unvollständig untersucht. Deshalb wurde in dieser Arbeit das Hauptaugenmerk auf die Identifizierung potenzieller Sekundärmetabolit (SM)-Gencluster im Genom gelegt. Die Kombination von verschiedenen Strategien, wie manuelle Annotation und bioinformatische Ansätze, erlaubte die Identifzierung von 4 potentiellen SM Genclustern (A-D). Die Auswahl von Cluster A für die weiteren Untersuchungen in dieser Arbeit beruhte auf seiner chromosomalen Lokalisation und der Analyse von Genexpressionsprofilen der Clustergene. Zur Analyse der Genexpression in U. maydis wurden alle verfügbaren Daten der öffentlich zugänglichen Datenbank „Gene Expression Omnibus“ in einer Excel-Tabelle zusammengefügt und normalisiert. Die Überexpression des TransKriptionsfaktors Mtf1 in Cluster A führte zu einer Aktivierung von mindestens 12 Genen, unter denen sich auch drei Polyketidsynthasen (pks3, pks4 und pks5), ein Cytochrom P450 (cyp4) und eine Versicolorin B-Synthase (vbs1) waren. Längere Induktion von Cluster A führte zur Produktion eines schwarz-grünen Pigments, das hauptsächlich aus 1,3,6,8-Tetrahydroxynaphthalin (T4HN) besteht. Daher wurde Cluster A Melanin-ähnlicher Cluster genannt. Dieses Ergebnis zeigte bereits, dass U. maydis Melanin über einen ungewöhnlichen Weg synthetisiert, da die meisten pilzlichen Melanine auf DHN, dessen Vorstufe T4HN ist, basieren. Mutanten mit fehlenden pks3, pks4, pks5 und cyp4-Genen zeigten keine Melaninanreicherung, was auf eine essentielle Funktion dieser Gene bei den ersten Schritten der Biosynthese hindeutet. Die Deletion von cyp4 führte zur Produktion von Orsellinsäure (OA) und zwei ihrer Derivate. Interessanterweise konnte durch Zugabe von zum Medium OA der Melanisierungsdefekt der pks3/pks4-Deletionsmutante ausgeglichen werden. Außerdem resultierte die simultane Überexpression der pks3 und pks4-Gene in der Produktion von OA, was darauf hindeutet, dass beide Gene an der OA-Synthese beteiligt sind. OA stellt daher ein wichtiges Zwischen produkt dar, das in nachfolgenden Reaktionsschritten als Substrat für weitere Umwandlungen zu T4HN verwendet wird. Diese Reaktionen werden vermutlich von Cpy4 und/oder Pks5 katalysiert. Überexpression von pks1, einer weiteren Polyketidsynthase-Gen in U. maydis, für das in früheren Arbeiten zusammen mit pks2 und lac1 eine Rolle bei der Melanisierung der Sporen beschrieben wurde, konnte den Phänotyp des Stammes MB215 pks3 Pcrg::mtf1 ausgleichen. Dies deutet darauf hin, dass Pks3 und Pks1 eine vergleichbare biochemische Funktion ausüben. Maiskeimlinge, die mit Stämmen mit Einzelgendeletionen des Melanin-ähnlichen Clusters infiziert wurden, zeigten keinen Effekt auf die Sporenfarbe und hatten nur einen geringen Einfluss auf die Virulenz. Dies unterstützt das vorherige Ergebnis, wonach pks1 und pks2 hauptsächlich zur Melanisierung während der Sporenbildung beitragen. Da die Deletionsmutanten SG200 pks3, SG200 pks4 und SG200 pks5 bei Wachstum auf Wasserstoffperoxid keine signifikanten Unterschiede zum Wildtyp (SG200) aufwiesen, deutet dies darauf hin, dass die Bildung dieses Melanin-ähnlichen Farbstoffs vermutlich eine Rolle bei anderen Stressantworten spielen könnte. Daher sind weitere Experimente nötig, um Bedingungen zu finden, bei denen die Gene dieses Clusters exprimiert sind.


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