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Titel: Untersuchung der immunstimulatorischen Eigenschaften des Phospholipids Cardiolipin
Autor: Kleer, Jessica Susann
Weitere Beteiligte: Bauer, Stefan (Prof. Dr.)
Veröffentlicht: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0604
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2017-06046
DOI: https://doi.org/10.17192/z2017.0604
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Investigation of the immunostimulatory properties of the phospholipid cardiolipin
Publikationsdatum: 2017-10-24
Lizenz: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0

Dokument

Schlagwörter:
Interleukin 6, Dotap, Mustererkennungsrezeptoren, Thrombozyt, Monozyt, Endosymbionten-Hypothese, MAP-Kinase, Dotap, pathogen-associated molecular pattern, Cardiolipin, endosymbiotic theory, Inflammasom, pattern recognition receptors, Pathogen-assoziierte molekulare Muster

Zusammenfassung:
Die Zielsetzung dieser Arbeit war die Untersuchung der immunstimulatorischen Fähigkeiten des Phospholipids Cardiolipin. Cardiolipin erfüllt die Kriterien eines Pathogen-assoziierten-molekularen-Musters (pathogen-associated molecular pattern; PAMP). Zudem wurde es als Bestandteil von Lipoproteinen niederer Dichte (Low Density Lipoprotein; LDL) nachgewiesen, welche nach oxidativer Modifikation von Zellen des angeborenen Immunsystems erkannt werden. Es wurde daher vermutet, dass Cardiolipin immunstimulatorische Eigenschaften hat. Initial konnte in dieser Arbeit per Stimulationsversuchen nachgewiesen werden, dass Cardiolipin in der Lage ist, eine Interleukin-6 (IL-6) Antwort in humanen Monozyten zu induzieren. Jedoch ist diese IL-6 Induktion abhängig von der Kostimulation der Monozyten mit Thrombozyten und Dotap. Wie Viktoria Laukemper in vorhergehenden Arbeiten gezeigt hat, führen Thrombozyten über extrazelluläre-Signal regulierte Kinasen (extracellular-signal regulated kinase; ERK) zu einer Kostimulation der Monozyten. Daher wurde in dieser Arbeit der Mechanismus, mit dem Dotap die Stimulation der Monozyten durch Cardiolipin beeinflusst, untersucht. In einem Versuch in dem DOTAP durch komplex-formende Substanzen ersetzt wurde, konnte nicht nachgewiesen werden, dass dieses für die Aufnahme des Cardiolipins in die Zelle notwendig ist. Nachdem auch die Ergebnisse einer Kinetik-Analyse darauf hindeuteten, dass Dotap nicht die Aufnahme des Cardiolipins in die Zelle vermittelt, konnte im Rahmen von Fluoreszenzfärbungen gezeigt werden, dass Cardiolipin eigenständig in die Zellen gelangt. Zudem zeigten die Fluoreszenzfärbungen, dass Cardiolipin innerhalb der Zelle partikuläre Strukturen formt. In weiteren Experimenten muss geklärt werden, in welches Zellkompartiment Cardiolipin aufgenommen wird. Im Zuge der Mikroskopie konnte weiterhin gezeigt werden, dass Thrombozyten ebenfalls Cardiolipin aufnehmen. Da Thrombozyten nicht zur aktiven Aufnahme von Stoffen fähig sind, konnte so bewiesen werden, dass Cardiolipin passiv in Zellen gelangt. Da im Rahmen der Fluoreszenzfärbung zudem gezeigt wurde, dass Thrombozyten während der Stimulation an die Monozyten binden, wurde nachgewiesen, dass Thrombozyten durch direkte Interaktion zu einer Aktivierung der Monozyten beitragen. Western Blot Analysen sollten zeigen ob DOTAP seinen Effekt auf die Monozytenstimulation durch Induktion einer kostimulatorischen Kaskade ausübt. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass DOTAP den ERK- Weg induziert, jedoch nicht, dass es durch diesen Mechanismus zu einer Aktivierung der Monozyten kommt. Weitere Experimente über die wechselseitige Beeinflussung der Mitogen-aktivierten Proteine (mitogen-activated protein; MAP) untereinander sind nötig, um den intrazellulären Mechanismus zu klären, der hinter der Zytokinproduktion nach Stimulation mit Cardiolipin liegt. Parallel wurde untersucht, ob exogen zugeführtes Cardiolipin durch das Inflammasom erkannt wird. Dies wurde für den Fall einer Kostimulation mit DOTAP und Thrombozyten nachgewiesen. Die Rolle des DOTAP wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht vollständig verstanden. Es ist möglich, dass es das Cardiolipin innerhalb des Zytosols stabilisiert, sodass es durch das Nlrp3-Inflammasom erkannt werden kann.

Summary:
The aim of this research was the investigation of the immunostimulatory properties of the phospholipid cardiolipin. Cardiolipin meets the criteria of a PAMP and is a component of LDL particles, which are recognized by receptors of the innate immune system as a result of oxidative modification. Previous publications suggest that cardiolipin acts immunogenic. In stimulation experiments, it could initially be detected that cardiolipin is able to induce IL-6 response in human monocytes; however, this induction depends on the co-incubation with platelet and DOTAP. As previous experiments by our Research Group have shown that platelets cause co-stimulation of monocytes through the ERK pathway, this study investigated the mechanism by which DOTAP influences the stimulation of monocytes via cardiolipin. By replacing DOTAP with complex-forming substances, it could not be proven that DOTAP is needed for cardiolipin uptake. Results of kinetic analyses also indicated that DOTAP does not mediate the uptake of cardiolipin into monocytes, as fluorescencent dye helped to detect that cardiolipin independently enters the cells. The fluorescent staining also allowed the observation that cardiolipin forms particulate structures within the monocytes. Further studies are needed to show in which cellular compartment cardiolipin localizes after entering the cells. Microscopical examination further demonstrated that platelets also take up cardiolipin. Thus, it was shown that cardiolipin passively enters the cell. The fluorescent staining revealed that the platelets attach to the monocytes during the stimulation, therefore it could be seen that platelets contribute to the activation of monocytes by directly interacting with them. Furthermore, Western blot was used to examine whether DOTAP exerts its effect by inducing a co-stimulatory signalling cascade. Indeed it could be shown that DOTAP induces the ERK pathway, without giving evidence to activate monocytes through this mechanism. Further investigation into how the MAP kinase pathways influence each other must seek to clarify the intracellular processes which lie behind the cytokine production after stimulation with cardiolipin. Parallel to these examinations, it was investigated whether exogenous cardiolipin is recognized by the inflammasome. This could be demonstrated in the case of co-stimulation with DOTAP and platelets. However, the role of DOTAP could not be fully understood in the context of this work. It is possible that it stabilizes cardiolipin within the cytosol, allowing it to be detected there by Nlrp3-inflammasome.


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